по микробиологии

«Реакция агглютинации и ее виды (РА)»

План:

1. Введение……………………………………………………………………………………..3

2. РА на стекле………………………………………………………………………………….4

3. Пробирочная РА…………………………………………………………………………….5

4. Используемая литература…………………………………………………………………..7

1. Введение.

Взаимодействие микробного антигена и антител носит строго специфический характер и направлено в животном организме на нейтрализацию возбудителя и его токсинов. Взаимодействие антигена и антител in vitro при определенных условиях сопровождаеют видимые феномены (агглютинация, преципитация, иммунный лизис), что позволяет использовать АГ-АТ-реакции, получившие название серологических (от лат. serum-сыворотка), в практических целях. Биофабрики выпускают антигены и иммуные сыворотки (антитела) известной специфической направленности (диагностические). При помощи таких сывороток в серологических реакциях можно идентифицировать неизвестный микроорганизм или, применяя известный антиген, обнаружить в организме антитела, синтезированные в ответ на внедрение возбудителя, и таким образом поставить диагноз (серологическая диагностика). Кроме того, серологические реакции можно использовать для оценки интенсивности иммунного ответа после вакцинации или перенесенной инфекционной болезни.

Реакции агглютинации, например непрямой агглютинации и Кумбса основаны на взаимодействии in vitro корпускулярных антигеновс антителами и способности образовавшихся комплексов выпадать в осадок. В качестве корпускулярных антигенов используют бактериальные клетки или растворимые антигены, экстрагированные из микроорганизмов и сорбированные на корпускулах носителей: эритроцитах, частицах латекса и т.д.

Антигенные детерминанты корпускулярных антигенов специфически взаимодействуют с гомологичными антителами (специфическая, невидимая фаза реакции), а затем комплексы антиген-антитело образуют крупные, идимые невооруженным глазом конгломераты, которые выпадают в осадок - агглютинат (неспецифическая, видимая фаза реакции). У безжгутиковых форм микробов (бруцелл) образуются зернистые агглютинанты, у жгутиковых (эшерихии, салмонеллы) - крупнохлопчатые, которые оседают на дно пробирки в виде перевернутого зонтика и при встряхивании легко разбиваются. Антигены и антитела взаимодействуют лишь в присутствии электролита (в 0,8%-м растворе хлорида натрия). На течение реакции влияют концентрация соли в электролите, количество микробных клеток во взвеси, крнцентрация сыворотки, рН, температура и другие факторы.

Реакция агглютинации (ра).

Различают агглютинацию специфическую, в основе к-рой лежит взаимодействие антигена с гомологичным антителом, содержащимся в организме животного, к-рому был введен данный антиген (иммуноагглютинация); неспецифическую (химическую), возникающую от изменения рН среды, концентрации электролитов; спонтанную, к-рую наблюдают при суспендировании бактерий (находящихся в R-форме) в физиологическом растворе и при нагревании, что связано с изменением коллоидного состояния бактериальной клетки. Антиген, участвующий в РА, называется агглютиногеном, антитело - агглютинином, образующийся осадок - агглютинатом. При образовании агглютината имеет значение количественное соотношение антигена и антител (феномен оптимума). При избытке или недостатке антител происходит задержка А.

Реакция агглютинации (РА) одна из первых иммунологических реакций, которую применяют в микробиологической практике. Впервые (1895) РА для диагностики брюшного тифа применил Ф. Видаль. Позже (1897) эту же реакцию для диагностики бруцеллеза у людей использовал А. Райт. РА нашла применение также при диагностике пуллороза цыплят, лептоспироза, инфекционного аборта кобыл, а также для типизации неизвестных культур микробов по заведомоизвестной агглютинирующей сыворотке. РА высокочувствительна; с ее помощью можно выявить 0,01 мкг азота белка антител в 1 мл.

Разработано несколько вариантов реакции агглютинации, различающихся по методическому исполнению и цели исследования.

2. Ра на стекле.

При этом варианте РА испытуемыми могут быть как сыворотка, так и антиген, но чаще всего этот вариант используют для идентификации микроорганизмов.

1. Для идентификации микроорганзма (м/о) на обезжиренное предметное стекло наносят раздельно каплю известной агглютинирующей сыворотки, например сальмонелиозной, и каплю физиологического раствора (контроль). Затем бактериологической петлей берут бактериальную массу изучаемой культуры из колонии в чашке Петри или с поверхности скошенного МПА в пробирке и суспендируют раздельно в иммунной сыворотке и физиологическом растворе до получения гомогенной взвеси. Результат учитывают через 2…4 мин.

Учет результатов: в контрольной пробе изменения должны отсутствовать. При специфическом соответствии культуры бактерий иммунной сыворотке появляются хлопья агглютината (положительный результат), в случае отсутствия феномена агглютинации делают заключение о том, что исследуемая культура бактерий не соответствует иммунной сыворотке.

2. Обнаружение аниттел в исследуемой сыворотке крови рассмотрим на примере роз-бенгал пробы, применяемой при серодиагностике бруцеллеза. На предметное стекло наносят 0,3 мл исследуемой сыворотки крови животного и 0,03 мл бруцеллезного антигена (окрашенные розовым-бенгальским клетки бруцелл). Компоненты тщательно перемешивают покачиванием стекла и через 4 мин учитывают результат.

Учет результатов: при положительной реакции появляются розовые хлопья агглютината. Серологическую реакцию подобного типа относят к качественной, так как с ее помощью можно выявлять антитела к возбудителю в сыворотке крови животного, но невозможно оценить их количественное содержание.

Реакция агглютинации (РА) - это склеивание и выпадение в осадок микробов или других клеток под действием антител в присутствии электролита. Образовавшийся осадок называют агглютинатом.

РА используют:

1. Для обнаружения антител в сыворотке крови больного (серодиагностика).

2. Для определения вида и серовара выделенной от больного чистой культуры патогенных микроорганизмов (серотипирование).

Реакцию агглютинации используют для определения антител в сыворотке крови больных, например, при брюшном тифе и паратифах (реакция Видаля), бруцеллёзе (реакции Райта, Хеддлсона), туляремии, лептоспирозах и других инфекционных болезнях, а также для определения выделяемого от больного возбудителя (кишечные инфекции, коклюш и др.). РА применяется для определения групп крови, резус - фактора и др.

Для реакции необходимы следующие компоненты:

1. Антиген (агглютиноген) должен быть корпускулярным, то есть это взвесь живых или убитых микроорганизмов (диагностику м), эритроцитов или других клеток. Обычно используют суточную культуру микроорганизмов, выращенную на скошенном агаре. Культуру смывают 3 - 4 мл изотонического раствора, переносят в стерильную пробирку, определяют густоту. Взвесь должна быть гомогенной и содержать до 3 млрд. микробных клеток в 1 мл. Применение взвеси убитых микробов - диагностикумов - облегчает работу (готовятся на производстве).

2. Антитела (агглютинины) находятся в сыворотке больного (при серодиагностике) или в агглютинирующей сыворотке (при серотипировании). Агглютинирующие сыворотки получают путём иммунизации кроликов убитыми бактериями.

Титром агглютинирующей сыворотки называется наибольшее её разведение, в котором на реагирует с соответствующим антигеном в определённых условиях опыта.

Агглютинирующие сыворотки могут быть нативными (неадсорбированными) и адсорбированными. Нативные сыворотки в небольших разведениях взаимодействуют не только с тем видом микроорганизмов, которым иммунизировали животное для получения сыворотки, но и с родственными видами микроорганизмов, т. к. в них присутствуют групповые антитела (антитела к микроорганизмам, имеющим общие антигены). Нативные сыворотки используются для развёрнутой реакции агглютинации (при серодиагностике), где учитывается не только наличие реакции, но и динамика нарастания титра антител.

Если из нативной сыворотки извлечь (адсорбировать) групповые антитела путём взаимодействия с родственными бактериями, имеющими групповые антигены, получаются адсорбированные сыворотки. Адсорбированные сыворотки могут быть монорецепторными (или типоспецифическими), содержащими антитела только к одному антигенному рецептору, Поливалентные сыворотки состоят из смеси нескольких адсорбированных или неадсорбированных сывороток. Адсорбированные сыворотки используют для реакции агглютинации на стекле.

При иммунизации животных подвижными бактериями с Н-антигеном получают Н-агглютинирующие сыворотки, содержащие Н-антитела (например, сальмонеллёзная монорецепторная Н-агглютинирующая сыворотка). Иммунизацией О-антигеном получают О-агглютинирующие сыворотки, содержащие О-антитела, (например, сальмонеллёзная групповая адсорбированная О-агглютинирующая сыворотка, противохолерная О-агглютинирующая сыворотка). Иммунизацией Н- и О-антигенами получают сыворотки с Н- и О -антителами.

Причём О-агтлютинины дают мелкозернистый агглютинат, а Н-агглютинины - крупнохлопчатый осадок.

3. Электролит - изотонический раствор NaCl (0,9 % раствор хлорида натрия, приготовленный на дистиллированной воде).

Существует два основных метода постановки реакции агглютинации: реакция на стекле (иногда ее называют ориентировочной или пластинчатой) и развернутая реакция (в пробирках)

Постановка реакции агглютинации на стекле. На обезжиренное предметное стекло наносят две капели сыворотки и каплю изотонического раствора хлорида натрия. Диагностическая агглютинирующая сыворотка берётся в одном разведении, которое в зависимости от её титра составляет 1:10, 1:25, 1:50 или 1:100. В одну из капель сыворотки и каплю изотонического раствора петлей вносят культуру исследуемого микроорганизма и тщательно перемешивают. Капля хлорида натрия с микроорганизмами - контроль антигена, капля сыворотки без микроорганизмов - контроль сыворотки. Нельзя переносить культуру из капли с сывороткой в каплю с NaCl. Реакция протекает при комнатной температуре в течение 1-3 мин. Если контроль сыворотки остается прозрачным, в контроле антигена наблюдается равномерное помутнение, а в капле, где культура смешана с сывороткой, появляются хлопья агглютината, то результат считают положительным. Если в капле с сывороткой и антигеном равномерное помутнение, то это отрицательный результат. Реакция отчётливее видна на тёмном фоне.

Сыворотка

1. контроль антигена

2. контроль сыворотки

Агглютинация - это склеивание и выпадение в осадок микробов или других клеток под действием антител в присутствии электролита (изотонического раствора хлорида натрия). Группы склеенных бактерий (клеток) называют агглютинатом. Для реакции агглютинации необходимы следующие компоненты:

1. Антитела (агглютинины), которые находятся в сыворотке больного или иммунного животного.

2. Антиген - взвесь живых или убитых микробов, эритроцитов или других клеток.

3. Изотонический (0,9%) раствор хлорида натрия.

Реакцию агглютинации для серодиагностики применяют при брюшном тифе и паратифах (реакция Видаля), при бруцеллезе (реакция Райта и Хеддлсона), туляремии и т.д. Антителом при этом является сыворотка больного, а антигеном известный микроб. При идентификации микробов или других клеток антигеном служит их взвесь, а антителом - известная иммунная сыворотка. Эту реакцию широко применяют для диагностики кишечных инфекций, коклюша и др.

Методы постановки РА

Ориентировочная РА на стекле

Развернутая РА

(объемный метод)

Реакция коагглютинации

Развернутая РА на стекле (сероидентификация)

Реакция агглютинации на стекле. На обезжиренное предметное стекло наносят две капли специфической (адсорбированной) сыворотки и каплю изотонического раствора хлорида натрия. Неадсорбированные сыворотки предварительно разводят в соотношении 1:5 - 1:100. Капли на стекло необходимо наносить так, чтобы между ними было расстояние. Культуру петлёй или пипеткой тщательно растирают на стекле, а потом вносят в каплю изотонического, раствора хлорида натрия и в одну из капель сыворотки, размешивая в каждой до образования гомогенной взвеси. Капля сыворотки, в которую не внесена культура, является контролем сыворотки.

Внимание! Нельзя переносить культуру из сыворотки в каплю изотонического раствора хлорида натрия, которая является контролем антигена. Реакция протекает при комнатной температуре в течение 1-3 мин. Если контроль сыворотки остаётся прозрачным, в контроле антигена наблюдается равномерная муть, а в капле, где культура смешана с сывороткой, появляются хлопья агглютината на фоне прозрачной жидкости, результат реакции считается положительным.

Диагностическая Физиологический

сыворотка +культура раствор + культура

Развёрнутая реакция агглютинации (объемный метод). Готовят последовательные, чаще всего двукратные, разведения сыворотки. Метод называют объёмным. Для определения титра антител в сыворотке крови возьмите 6 пробирок. В первую пробирку налейте 1 мл исходного разведения сыворотки 1:50 и во все 6 пробирок градуированной пипеткой внесите по 1 мл физиологического раствора. В первой пробирке получится разведение сыворотки 1:100 при объёме 2 мл. Из первой пробирки 1 мл перенесите во вторую пробирку, где разведение станет 1:200. Так сделайте ряд последовательных разведений сыворотки в 5 первых пробирках (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600). Из пятой пробирки 1 мл вылейте в дезинфицирующий раствор. Во все 6 пробирок добавьте по 2 капли диагностикума. Шестая пробирка является контролем культуры, так как содержит только физиологический раствор и диагностикум.

Ингредиенты	номер пробирки
						контроль сыворотки	контроль диагности-кума
Физиологический
Сыворотка больного в
разведении 1:50
Диагностикум (капли)
Разведение сыворотки

Такой контроль необходим для исключения спонтанной агглютинации культуры. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при температуре 37°С на 2 часа, а затем оставляют на сутки при комнатной температуре, после чего производят учёт результатов реакции агглютинации. При постановке реакции агглютинации с сыворотками детей первых месяцев жизни в связи с функциональной неполноценностью антителообразования необходимо выявление более низких титров антител, что учитывается при разведении сыворотки. Исходное разведение сыворотки берут 1:25. В первой пробирке получают разведение 1:50, затем 1:100 и т.д.

При положительном результате реакции в пробирках видны склеевшиеся клетки в виде зерен или хлопьев на фоне прозрачной жидкости. Агглютинат постепенно оседает на дно в виде «зонтика», а жидкость над осадком просветляется. Контроль антигена равномерно мутный.

По характеру осадка различают мелко- и крупнозернистую (хлопьевидную) агглютинацию. Мелкозернистая агглютинация получается при работе с О-сыворотками. Крупнозернистая - при взаимодействии подвижных микробов со жгутиковыми Н-сыворотками. Она наступает быстрее мелкозернистой, образующийся при этом осадок очень рыхлый и легко разбивается.

Интенсивность реакции выражается следующим образом:

Все клетки осели, жидкость в пробирке совершенно прозрачна. Результат реакции резко положительный;

Осадок меньше, нет полного просветления жидкости. Результат реакции положительный;

Осадок еще меньше, жидкость мутнее. Результат реакции сомнительный;

на дне пробирки незначительный осадок, жидкость мутная. Сомнительный результат реакции;

Осадка нет, жидкость равномерно мутная, как в контроле антигена. Отрицательный результат реакции

Агглютинацией называется склеивание бактерий в результате взаимодействия с ними специфических AT. Для проведения РА необходимы три компонента: 1) АГ (агглютиноген); 2) AT (агглютинин); 3) раствор электролита (изотонический раствор хлорида натрия). В реакции агглютинации принимают участие только корпускулярные антигены (бактерии, эритроциты, нагруженные антигеном частицы латекса).

Реакция агглютинации на стекле. На обезжиренное предметное стек­ло пипеткой наносят каплю диагностической сыворотки (разведение сыворотки 1:10 - 1:20). Бактериологической петлей берут чистую культуру исследуемого микроорганизма с поверхности скошенного агара, переносят в каплю сыворотки и перемешивают. Результат реакции учитывают невооруженным глазом через 3-5 мин. При положительной реакции в капле сыворотки отмечают появление хлопьев (крупных или мелких), хорошо видимых на темном фоне при покачивании предметного стекла. В случае отрица­тельной реакции жидкость остается равномерно мутной.

Реакция агглютинации в пробирках. В ряд пробирок вносят по 1 мл физиологического раствора. В первую пробирку прибавляют равный объем исследуемой сыворотки крови. Готовят последовательные двукратные разведения сыворотки (титрование сыворотки), после чего в каждую пробирку вносят по 2 капли взвеси инактивированных бактерий (диагностикум). Пробирки помещают на 2 ч в термостат при 37 °С. Реакция протекает с образованием мелких хлопьев, невидимых невооруженным глазом, поэтому учет результатов проводят под небольшим увеличением в специальном приборе – агглютиноскопе. Интенсивность агглютинации учитывают по системе «четыре плюса»: полная агглютинация - 4+, частичная агглютинация - 3+ или 2+, сомнительный результат - +. За титр антител в исследуемой сыворотке принимают последнее разведение, в котором наблюдается агглютинация на 2+.

Реакцию агглютинации в пробирках (развернутая реакция агглютинации) проводят для определения титра антител к возбудителям брюшного тифа и паратифов (реакция Видаля), бруцеллеза (реакции Райта), сыпного тифа (реакция Вейгля).

Агглютинация (от лат. agglutinatio - склеивание) - склеивание (соединение) антигеннесущих корпускулярных частиц (цельные клетки, частицы латекса и др.) молекулами специфических антител в присутствии электролитов, которое заканчивается образованием видимых невооруженным глазом хлопьев или осадка (агглютината). Характер осадка зависит от природы антигена: жгутиковые бактерии дают крупнохлопьевидный осадок, безжгутиковые и бескапсульные - мелкозернистый, капсульные - тяжистый. Различают агглютинацию прямую, при которой во взаимодействии со специфическими антителами непосредственно участвуют собственные антигены бактериальной или любой другой клетки, например эритроцитов; и непрямую, или пассивную, при которой бактериаль­ные клетки или эритроциты, или частицы латекса являются носителями не собственных, а сорбиро­ванных на них чужих антигенов (или антител) для выявления специфических к ним антител (или антигенов). В реакции агглютинации участвуют главным образом антитела, относящиеся к классам IgG и IgM. Она протекает в две фазы: вначале происходит специфическое взаимодействие активного центра антител с детерминантом антигена, эта стадия может происходить в отсутствие электролитов и не сопровождается видимыми изменениями реагирующей системы. Для второй стадии - образова­ния агглютината - необходимо наличие электролитов, которые снижают электрический заряд комп­лексов антиген + антитело и ускоряют процесс их склеивания. Эта фаза заканчивается образовани­ем агглютината.

Реакции агглютинации ставят либо на стеклянных, либо на гладких картонных пластинках, либо в стерильных агглютинационных пробирках. Реакции агглютинации (прямые и пассивные) на стекле обычно применяют в качестве ускоренного метода обнаружения специфических антител в сыворотке больного (например, при бруцеллезе) или для серологической идентификации возбудителя. В после­днем случае обычно используют хорошо очищенные (адсорбированные) диагностические сыворотки, содержащие только монорецепторные антитела или их набор к различным антигенам. Несомненным достоинством реакции агглютинации на стекле является простота ее постановки и то, что она протекает несколько минут или даже секунд, так как оба компонента в ней используются в концент­рированном виде. Однако она имеет лишь качественное значение и менее чувствительна, чем пробирочная. Развернутая реакция агглютинации в пробирках дает более точные результаты, ибо она позволяет определить количественное содержание антител в сыворотке (установить ее титр) и при необходимости зарегистрировать факт нарастания титра антител, что имеет диагностическое значе­ние. Для постановки реакции в агглютинационные пробирки вносят определенным образом разведен­ную 0,85%-ным раствором NaCl сыворотку и равный объем (обычно 0,5 мл) суспензии стандартного диагностикума (или исследуемой культуры), содержащего в 1 мл 1 млрд бактерий. Учет результатов реакции агглютинации производят предварительно через 2 ч инкубации пробирок при 37 °С и окончательно через 20-24 ч по двум признакам: наличию и величине осадка и степени прозрачности надосадочной жидкости. Оценку осуществляют по четырехкрестной системе. Реакция обязательно сопровождается контролем сыворотки и антигена. В тех случаях, когда развернутую реакцию агглю­тинации в пробирке ставят для серологической идентификации возбудителя, она имеет диагностичес­кое значение, если реакция оценена как положительная при разведении диагностической сыворотки не менее половины ее титра.

Необходимо учесть, что при смешивании растворов гомологичных антигенов и антител не всегда наблюдаются видимые проявления реакции агглютинации. Осадок образуется только при некоторых оптимальных соотношениях обоих компонентов реакции. Вне этих пределов, при значительном избытке антигена или антител, реакции не наблюдается. Это явление получило название «феномена прозоны». Оно наблюдается как при реакции агглютинации, так и при реакции преципитации. Появление прозоны в иммунных реакциях объясняется тем, что участвующие в них антигены, как правило, являются полидетерминантными, а молекулы антител IgG имеют два активных центра. При избытке антител поверхность каждой частицы антигена покрывается молекулами антител так, что не остается свободных детерминантных групп, поэтому второй, несвязанный активный центр антител не может взаимодействовать с другой антигенной частицей и связывать их друг с другом. Образование видимого агглютината или преципитата подавляется также при избытке антигена, когда не остается ни одного свободного активного центра антител, и поэтому комплексы антиген + антитело + антиген не могут более укрупняться.

Варианты ускоренных реакций агглютинации. Реакция пассивной гемагглютинации и ее варианты

Классическая реакция агглютинации предусматривает использование корпускулярных антигенов. Однако в ней могут участвовать и растворимые антигены. Чтобы это стало возможным, такие антигены адсорбируют на иммунологически инертных частицах. В качестве носителя можно использо­вать частицы латекса или бентонита, однако в настоящее время наиболее часто применяют эритроци­ты животных или человека, улучшая их адсорбирующие свойства обработкой растворами танина, формалина или бензидина. Эритроциты, адсорбировавшие на себе антиген, называются сенсибилизи­рованными данным антигеном, а иммунная реакция, в которой они участвуют, - реакцией непрямой, или пассивной гемагглютинации (РНГА, или РПГА), так как эритроциты участвуют в ней пассивно.

РПГА ставят в специальных полистироловых пластинках с луночками, имеющими полусферическое дно. При использовании ее для серологической диагностики в этих луночках готовят двукратные разведе­ния в физиологическом растворе исследуемой сыворотки, и затем добавляют к ней в качестве диагности-кума взвесь сенсибилизированных эритроцитов. Учет результатов проводят через 2 ч инкубации при 37 °С по четырехкрестной системе. При положительной реакции агглютинировавшиеся эритроциты оседают на дно луночки и равномерно покрывают его в виде перевернутого зонтика. При отрицательной реакции эритроциты тоже оседают, жидкость становится прозрачной, осадок выглядит в виде маленького «диска» в центре луночки. Титром сыворотки в РПГА считается последнее ее разведение, которое еще дает ярко выраженную гемагглютинацию без значительных признаков наличия «диска».

РПГА может применяться также в качестве ускоренного метода бактериологической диагностики для обнаружения непосредственно в исследуемом материале неизвестных бактерий, вирусов, токси­нов, например возбудителей чумы, стафилококковых энтеротоксинов и др. При таком варианте поста­новки РПГА в роли известного компонента реакции используют эритроциты, адсорбировавшие извест­ные по своей специфичности антитела - антительный эритроцитарный диагностикум. Если исследуемый материал содержит достаточное количество известного антигена, РПГА будет положительна.

Вариантами использования РПГА являются: реакция нейтрализации антигена (РНАг), реакция нейтрализации антител (РНАт), реакция торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА). Для этих реакций используют антигенные и антительные эритроцитарные диагностикумы. Можно использовать одновременно две взаимно контролирующие однонаправленные реакции, например РПГА с антиген­ным диагностикумом и РНАг с антительным эритроцитарным диагностикумом.

Реакция нейтрализации антител (РНАт) заключается в том, что суспензию, содержащую искомый антиген, смешивают со специфической иммунной сывороткой, содержащей известные антитела, в соот­ветствующих объемах и инкубируют при 37 °С в течение двух часов. После этого добавляют антигенный эритроцитарный диагностикум. Смесь встряхивают и оставляют при комнатной температуре. Результаты учитывают через 3-4 ч и окончательно - через 18-24 ч. Если в исследуемом материале имеется антиген, он свяжет антитела (нейтрализует их), и поэтому гемагглютинация не произойдет.

По такому же принципу ставят реакцию нейтрализации антигена (РНАг). Только в этом случае в исследуемом материале обнаруживают антитела. Специфический антиген, добавленный к такому исследуемому материалу, будет связываться с антителами, содержащимися в нем, т. е. произойдет нейтрализация антигена антителами, и поэтому гемагглютинация при добавлении антительного эрит-роцитарного диагностикума не произойдет.

Реакция коагглютинации. Является одним из вариантов пассивной, т. е. опосредованной клет­ками-носителями антител ускоренной реакции агглютинации на стекле. В основу этой реакции поло­жено уникальное свойство золотистого стафилококка, имеющего в составе своей клеточной стенки белок А, связываться с Fc-фрагментами IgG и IgM. При этом активные центры антител остаются свободными и могут взаимодействовать со специфическими детерминантами антигенов. На предмет­ное стекло наносят каплю 2%-ной взвеси стафилококков, сенсибилизированных соответствующими антителами, и добавляют каплю взвеси исследуемых бактерий. При соответствии антигена антителам через 30-60 с происходит четкая агглютинация нагруженных антителами стафилококков.

Реакция латекс-агглютинации (ЛАГ). Носителем антител в этой диагностической системе являются мелкие стандартные частички латекса. Реакцию выполняют микрометодом в лунках на стекле. Основным условием успешной постановки ЛАГ является строгое соблюдение количественных соотношений компонентов системы: к 50 мкл исследуемого материала добавляют 10 мкл латекс-препарата, сенсибилизированного антителами. Специфичность ЛАГ контролируют с помощью трех конт­рольных тестов, содержащихся в коммерческих тест-системах: заведомо положительная реакция, заведомо отрицательная реакция и контроль качества латекс-суспензии по ЛАГ-несенсибилизирован-ным (не несущим антител) латексам с исследуемым материалом. В нашей стране в качестве носите­лей специфических антител используют полистироловые монодисперсные латексы с разными диамет­рами частиц (0,3; 0,66; 0,75; 0,8 мкм). ЛАГ используют для быстрого обнаружения микроорганизмов или их антигенов в исследуемом материале.

Иммуномагнитное обнаружение антигенов. Один из вариантов ускоренной реакции агглюти­нации на стекле связан с применением супермагнитных полимерных частиц, покрытых специфически­ми антителами. Одна такая частица связывает до 107- 108 клеток микроорганизмов, благодаря чему чувствительность данного метода достигает 5 КОЕ/мл. Иммуномагнитное обнаружение микроорганиз­мов можно применять в комплексе с ЦПР.

Реакция агрегат-гемагглютинации (РАГА). Позволяет быстро обнаружить в крови больных как свободно циркулирующие антигены (антигенемия), так и антигены, связанные с антителами - циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК). Для РАГА используют эритроциты, сенсибилизирован­ные соответствующими антителами. Добавление сыворотки крови больного, в которой содержатся антигены, к сенсибилизированным эритроцитам, на которых фиксированы антитела, приводит к склеи­ванию (агглютинации) эритроцитов и иммунных комплексов.

Антиглобулиновая проба Кумбса (реакция Р. Кумбса). При помощи реакций прямой и пассивной агглютинации определяют полные (двухвалентные) антитела. Неполные (моновалентные, блокирующие) антитела не выявляются этими методами, так как, соединяясь с антигеном, блокируют его, но не могут вызвать агрегации антигена в крупные конгломераты. Неполными (блокирующими) называют антитела, у которых функционирует только один активный центр; второй активный центр по неизвестной причине не срабатывает. Для выявления неполных антител используют специальную реакцию Кумбса (рис. 72). В реакции участвуют: сыворотка больного, в которой определяют неполные антитела, корпускулярный антиген-диагностикум, антиглобулиновая сыворотка, содержащая антитела к человеческому глобулину. Реакция протекает в два этапа:

Взаимодействие антигена с неполными антителами. Видимых проявлений при этом нет. Первый этап заканчивают отмывкой антигена от остатков сыворотки больного.

Взаимодействие антиглобулиновой сыворотки, полученной в результате иммунизации животного человеческим глобулином, с неполными антителами, адсорбированными на антигене. В силу того, что антиглобулиновые антитела двухвалентны, они связывают два одновалентных антитела отдельных комплексов АГ + неполное антитело, что приводит к их склеиванию и появлению видимого осадка.

ИММУНОМИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Иммунологические методы применяют для решения многих задач:

1. Оценка состояния иммунной системы человека (иммунного статуса) по определению количественных и функциональных характеристик клеток иммунной системы и их продуктов.

2. Определение состава и характеристик тканей человека: групп крови, резус фактора, трансплантационных антигенов.

3. Диагностика инфекционных болезней и резистентности к ним по обнаружению и установлению титров антител (серодиагностика), выявлению антигенов возбудителей в организме, определению клеточных реакций на эти антигены.

4. Сероидентификация культур бактерий и вирусов, выделенных из организма человека и животных.

5. Выявление в организме человека и во внешней среде любых веществ, обладающих антигенными или гаптенными свойствами (гормоны, ферменты, яды, лекарства, наркотики и т.п.).

6. Выявление иммунопатологических состояний, аллергий, трансплантационных и противоопухолевых реакций.

Процесс взаимодействия антигена и антитела в серологических реакциях протекает в две фазы:

1) специфическая - фаза взаимодействия, в которой происходит комплементарное соединение активных центров антител (паратопов) и эпитопов антигена. Обычно эта фаза длится несколько секунд или минут;

2) неспецифическая - фаза проявления, характеризуется внешними признаками образования иммунных комплексов. Эта фаза может развиваться от нескольких минут до нескольких часов.

Оптимальное специфическое взаимодействие антител с антигеном происходит в изотоническом растворе с рН, близким к нейтральному. Реакция антиген-антитело в системе in vitro может сопровождаться возникновением нескольких феноменов

· агглютинации,

· преципитации,

· лизиса.

Внешние проявления реакции зависят от физико-химических свойств антигена (размер частиц, физическое состояние), класса и вида антител (полные и неполные), а также условий опыта (консистенция среды, концентрация солей, рН, температура).

Поливалентность антигенов и антител обеспечивает возникновение видимых невооруженным глазом агрегатов. Это происходит в соответствии с теорией образования сетей, согласно которой к образовавшемуся комплексу антиген-антитело последовательно присоединяются другие молекулы антител и антигена. В результате формируются сетевые структуры, которые превращаются в агрегаты, выпадающие в осадок. Характер и выраженность реакции зависят от количественного соотношения антигенов и антител. Наиболее интенсивно реакции проявляются в том случае, если реагенты находятся в эквивалентном соотношении.

Необходимое условие образование решетки (сетей) - наличие более трех антигенных детерминант на каждую молекулу антигена и по два активных центра на каждую молекулу антитела. Молекулы антигена являются узлами решетки, а молекулы антител - связующими звеньями. Область оптимальных соотношений (зона эквивалентности) концентраций антигена и антител, когда в надосадочной жидкости после образования осадка не обнаруживаются ни свободные антигены, ни свободные антитела.

Агрегаты, способные выпадать в осадок, образуются при соединении антигенов с полными антителами. Неполные антитела (моновалентные) не вызывают образования сетевых структур и крупных агрегатов. Для выявления таких антител используют специальные методы, основанные на использовании антиглобулинов (реакцию Кумбса).

Серологические реакции, благодаря высокой специфичности и чувствительности, применяют для выявления и количественного определения антигенов и антител. Количество иммунореагентов в реакциях выражают титром - максимальным разведением сыворотки или антигена, при котором еще наблюдается реакция.

Серологические реакции в микробиологических и иммунологических лабораториях используют в двух целях:

1) для сероидентификации микроорганизмов, токсинов, антигена вообще с помощью известного антитела (иммунной диагностической сыворотки),

2) для серодиагностики - определения природы антитела в сыворотке крови больного при бактериальных, вирусных, реже других инфекционных заболеваниях с помощью известного антигена (диагностикума).

Для определения родовой, видовой и типовой принадлежности антигена необходимы заведомо известные иммунные диагностические сыворотки. Их получают путем многократного введения животным (чаще кроликам) в нарастающих дозах убитых или живых микроорганизмов, продуктов их распада, обезвреженных или нативных токсинов. После определенного цикла иммунизации животных делают массивное кровопускание или тотальное обескровливание животного. Кровь, собранную в стерильную посуду, сначала помещают в термостат при температуре 37°С на 4 - 6 ч для ускорения свертывания, затем - в ледник на сутки. Полученную прозрачную сыворотку отсасывают в стерильную посуду, добавляют консерванты, определяют титр антител, проверяют на стерильность и разливают в ампулы.

Используются неадсорбированные и адсорбированные диагностические сыворотки. Неадсорбированные сыворотки обладают высокими титрами антител, но способны давать групповые (перекрестные) реакции.

Адсорбированныесыворотки отличаются строгой специфичностью действия (реагируют только с гомологичным антигеном). Сыворотки, содержащие антитела только к одному определенному антигену называются монорецепторными.

Выпускают также сыворотки, меченные флюорохромами, ферментами, радиоизотопами, которые позволяют с высокой степенью точности обнаружить даже следы антигена.

В качестве антигенов (диагностикумы) в серологических реакциях применяют взвеси живых или убитых бактерий, продуктов их расщепления, токсины, вирусы. В ряде случаев используют экстракты или выделенные химическим путем антигены из микроорганизмов и тканей животных.

Все иммуномикробиологические методы можно разделить на 3 группы :

1) основанные на прямом взаимодействии антигена с антителом (феномены агглютинации, преципитации, гемагглютинации, иммобилизации и др.);

2) основанные на опосредованном взаимодействии антигена с антителом (реакции непрямой гемагглютинации, коагглютинации, латекс-агглютинации, угольной аггломерации, бентонит-агглютинации, связывания комплемента и др.);

3) с использованием меченых антител или антигенов (метод флюоресцирующих антител, иммуноферментный и радиоиммунный анализы и другие методы).

РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ

В этих реакциях принимают участие антигены в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и другие корпускулярные антигены), которые склеиваются антителами и выпадают в осадок.

Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компонента: 1) антиген (агглютиноген);

2) антитело (агглютинин)

3) электролит (изотонический раствор натрия хлорида).

Ориентировочная реакция агглютинации (РА)

Ориентировочная, или пластинчатая, РА ставится на предметном стекле при комнатной температуре. Для этого пастеровской пипеткой на стекло наносят раздельно каплю сыворотки в разведении 1:10 - 1:20 и контрольную каплю изотонического раствора натрия хлорида. В ту и другую бактериологической петлей вносят колонии или суточную культуру бактерий (каплю диагностикума) и тщательно перемешивают их. Реакции учитывают через несколько минут визуально, иногда с помощью лупы (х5). При положительной РА в капле с сывороткой отмечают появление крупных и мелких хлопьев, при отрицательной - сыворотка остается равномерно мутной.

Развернутая реакция агглютинации с целью выявления титра специфических антител у больного.

Развернутая РА для серодиагностики ставится в сыворотке больных. Ее разводят и изотоническом растворе натрия хлорида от 1:50 - 1:100 до 1:800 или 1: 1600. Так как в более низких титрах сыворотки могут находиться нормальные агглютинины, имеющиеся у здоровых людей или больных с другим диагнозом (диагностический титр). В качестве антигена в этой реакции используют диагностикумы - заведомо известные взвеси, как правило, убитых бактерий.

В агглютинационные пробирки предварительно разливают по 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. В первую из них доливают 1 мл сыворотки, разведенной 1:100, и, смешав ее, 1 мл переносят во вторую, из второй - в третью и т.д. В полученные двухкратные разведения сывороток (от 1:100 до 1:1600 и более) вносят по 1-2 капли взвеси бактерий, содержащей 3 млрд микробных тел в 1 мл. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37°С на 2 часа, затем сутки выдерживают при комнатной температуре.

Учет реакции развернутой агглютинации производят, оценивая последовательно каждую пробирку, начиная с контрольных, при осторожном встряхивании. В контрольных пробирках агглютинации не должно быть. Интенсивность реакции агглютинации отмечают следующими знаками: ++++ - полная агглютинация (хлопья агглютината в абсолютной прозрачной жидкости); +++ - неполная агглютинация (хлопья в слабоопалесцирующей жидкости); ++ - частичная агглютинация (хлопья четко различимы, жидкость слегка мутная); + - слабая, сомнительная агглютинация - жидкость очень мутная, хлопья в ней плохо различимы; - - отсутствие агглютинации (жидкость равномерно мутная).

За титр сыворотки принимают последнее ее разведение, в котором интенсивность агглютинации оценивается не менее чем два плюса (++)