Генетическое типирование опухоли. Днк в криминалистике и науке Какие существуют типы ВПЧ

ВПЧ типы (вирус папилломы человека) проявляются поражением кожи и слизистых оболочек различными наростами: папилломами и бородавками. Это является следствием проникновения в организм папилломавируса. Ошибочно думать, что только внешними и внутренними новообразованиями воздействие вируса на организм человека ограничится. Некоторые типы папиллом могут привести к возникновению злокачественных опухолей. Поэтому главная цель - соблюдать бдительность при обнаружении на теле необычных наростов.

ВПЧ типы известны были предкам ещё в первые века нашей эры. Древние лекари с точностью определяли, что такие наросты передаются от больного человека к здоровому половым путём. То, что причиной появления бородавок и папиллом является вирус, учёные смогли доказать только в начале прошлого века.

Этот вирус относится к роду папиломавирусов, передаётся при контакте с живым организмом через верхний слой кожи, где и размножается внутри клеток и слизистых оболочек, вызывая изменения по типу бородавок и папиллом.

Во внешней среде вирус может существовать недолго, есть примеры, когда возбудителя можно «подхватить» в сауне или бане, так как он прекрасно чувствует себя во влажной среде. Весь его жизненный цикл совершается внутри клеток донорского организма. Он может находиться долгое время в клетках кожи, вызывая их неправильное деление.

Папилломавирус является одним из распространённых, передаётся при половом контакте. Число заражённых этим вирусом людей растёт с каждым годом. На сегодня около 90% населения мира является носителем папилломавируса. Главная опасность данного вируса в том, что, долго находясь в организме, некоторые его типы провоцируют онкологические заболевания.

Типы вируса

Типы вируса папилломы человека сегодня представлены очень широко. ВПЧ типирование насчитывает более ста разновидностей.

Разные типы новообразований, вызванных ВПЧ, вызывают в организме изменения, которые проявляются внешне и внутренне. Многие из них для человека не опасны, но есть такие, которые, долгое время находясь в организме человека, могут перерождаться в злокачественные опухоли.

В зависимости от возможности вызывать рак в организме, выделяются следующие типы вирусов:

не переходящие в онкологическое заболевание (1-5,10, 28,49);
редко вызывающие онкологию (6, 11, 13, 32, 34, 40-44, 51, 72);
средний процент онкоперерождения (26, 30, 35, 52, 53, 56, 58, 65);
высокий процент образования раковых опухолей (16, 18, 31, 33, 39, 45, 50, 59, 61, 62, 64, 68, 70, 73).

Последняя группа особенно опасна для женщин, так как часто вызывает рак шейки матки. Самые опасные типы, вызывающие рак в 94% случаев, – это 16, 18, 45.

Особое внимание должны уделить своему здоровью люди, у которых выявлены типы папиллом 56 и 66, способные привести к развитию особого вида рака – карциномы.

Данная классификация на основании исследований учёных меняется. Так произошло с типом 58, который из последней группы перешёл в предпоследнюю.

Если человек является носителем ДНК вируса папилломы, то он должен регулярно наблюдаться у врача-онколога, проходить обследование и сдавать необходимые анализы.

Онкогенные типы

Исходя из того факта, что некоторые типы ВПЧ могут быть онкоопасными, специалисты их разделили на несколько групп, показывающих возможный риск развития злокачественной опухоли:

безопасные;
с низким риском;
с высоким риском.

Большие опасения вызывает последняя группа. В этом случае можно наблюдать папилломы и остроконечные кондиломы, поселившиеся на репродуктивных органах представителей обоих полов. При их обнаружении посещение онколога обязательно. Врач назначит дифференцированное определение ДНК ВПЧ и после этого примет решение об удалении таких наростов.

Анализ на ВПЧ у женщин, заболевших раком шейки матки, показывает наличие 16 и 18 типа. Они бывают обнаружены у двух из трёх заболевших женщин.

Если анализ крови показывает наличие вируса папилломы человека онкогенного типа, это совсем не значит, что злокачественная опухоль обязательно разовьётся. ВПЧ у женщин может повысить риск развития опухоли. Поэтому при соответствующем своевременном лечении здоровью ничего не угрожает.

Кроме рака репродуктивных органов, ВПЧ онкогенного типа может поразить мочевой пузырь у мужчин. При этом вирус подавляет гены эпителия мочевыводящих путей, провоцируя их перерождение в злокачественную опухоль.

Диагностика симптомы заболевания

Медицинская наука сегодня имеет на вооружении методы, позволяющие точно определить, какая разновидность вируса вызвала появление новообразований на теле пациента.

Среди них часто применяются следующие методы:

Визуальное обследование. Одним из клинических проявлений является наличие на теле пациента папиллом, кондилом, бородавок. Если они имеются на репродуктивных органах и в зоне анального отверстия, назначаются дополнительные исследования.

Биопсия (кольпоскопия). Назначается при проблемах с тканями шейки матки. Для процедуры берётся уксусная кислота и раствор Люголя для обработки. При наличии ДНК папилломавируса на заражённом участке образуется характерный рисунок.
Цитология. Анализ мазков при помощи ПАП-теста. Дополнительно проводится гистология.
ПЦР (полимеразная цепная реакция). Способ хорош тем, что кроме самого вируса обнаруживает генотипирование ВПЧ. Данный анализ также выявляет быстротечные само излечивающиеся типы ВПЧ.

Последнее исследование должно включать пробы на все 15 онкогенных типов вируса. Хотя в нашей стране из них активны десять.

Если результаты диагностики говорят о наличии вируса в крови и дисплазии шейки матки, метод ПЦР с большой вероятностью обнаружит риск развития онкозаболевания.

Симптомы заболевания

Большей частью папилломавирус в организме носителя находится в бессимптомной форме. Этому способствует иммунитет, который подавляет все проявления.

Когда иммунитет слабеет, все типы вируса сразу активируются. Они собираются вместе и начинают воздействовать на клетки кожи. Нормальное воспроизводство нарушается, процесс деления клеток кожи ускоряется.

Как следствие этого появляются разные наросты. Именно они при визуальном осмотре говорят об инфицировании папилломавирусом.

В зависимости от типа, могут появляться следующие виды наростов:

Бородавки. Круглые, плотные наросты до 1 см в диаметре, с чётко очерчёнными границами, шершавой поверхностью, разного цвета. Находятся на открытых местах. Не опасны для человека.
Папилломы. Мягкий нарост на ножке цвета кожи, с шершавой поверхностью. Любит влажные места на теле. Размножаются очень быстро. Некоторые типы опасны.
Кондиломы. Похожи на папилломы. Находятся в области наружных репродуктивных органов и заднего прохода. Размножаются быстро, образуют целые грозди. Опасны для человека.

Заражение вирусом происходит при половом контакте. Признаки могут появиться не сразу, а даже спустя полгода.

Попав в организм, вирус проходит четыре стадии:

латентное течение - изменений в организме нет, наличие вируса покажет только анализ;
появление клинических признаков - среди них наросты на коже;
дисплазия - вирус проникает в клетки, и они начинают изменяться, тип вируса покажет гемотест;
карцинома - клетки мутируют, появляется злокачественная опухоль.

Возможные заболевания

ДНК типирование ВПЧ 27 типов обуславливает разные заболевания, которые могут появиться у человека после заражения.

Среди таких заболеваний можно выделить следующие:

Разные виды бородавок. Инфекция попадает бытовым путём. Подвержены ей дети и молодые люди. Иммунитет обычно справляется. Подошвенные бородавки излечиваются хирургическим путём.
Остроконечная кондилома. Поражает половые органы.
Эпидермодисплазия. Плоские бородавки розового цвета, вызывают рак кожи.
Ларингеальный папилломатоз. Присущ новорожденным детям. Затрудняет дыхание.
Бовеноидный папулёз. Характерен для мужчин, поражает слизистую.

Особое внимание надо обратить на признаки заболевания беременным женщинам, так как вирус может попасть к малышу во время родов.

Лечение и профилактика

Большинство наростов сходят сами в течение нескольких лет. При этом в организме на перенесённый тип вируса вырабатывается иммунитет, который остаётся на всю жизнь. Лечение при данном заболевании включает два этапа: применение противовирусных препаратов и удаление хирургическим путём.

Лекарственная терапия включает такие препараты: Салициловая кислота, Блеомицин, Имиквимод, Ретиноиды, Эпиген, Ферезол, Подофиллотоксин, Солкодерм.

Для удаления применяется криотерапия, лазеротерапия.

Существует также большая группа препаратов народной медицины. Это чистотел, одуванчик, каланхое, лук, алое, лимоны, полынь, клюква и др. Из них готовятся отвары, настойки, аппликации, втирания, используется сок, мякоть и т. д.

Для того чтобы предупредить заражение, применяются профилактические меры, а также вакцинация.

К мерам профилактики относятся:

обеспечение безопасной половой жизни;
регулярное посещение врача;
здоровый образ жизни;
вакцинация.

Если принять меры по предупреждению заболевания, то можно никогда не узнать на себе, что такое папилломавирус человека.

Наиболее часто в настоящее время используют два способа ДНК-типирования патогенных микроорганизмов, в основе которых лежит метод ПЦР. В первом случае используют один или несколько коротких праймеров произвольной первичной структуры длиной в 6–15 нуклеотидов, которые из-за своих малых размеров обладают низкой специфичностью в отношении конкретных генетических локусов и способны гибридизоваться со многими сайтами геномной ДНК. Во втором случае применяют специфические олигонуклеотидные праймеры длиной в 20–27 нуклеотидов, последовательности которых фланкируют исследуемую последовательность нуклеотидов в бактериальном геноме.

Рис. II.35. Схема ДНК-типирования микроорганизмов с использованием ПЦР и праймеров произвольной структуры

а – штаммоспецифические различия, обусловленные разной локализацией участков ДНК, взаимодействующих с праймерами. В ДНК штаммов 2 и 3 отсутствует участок, который имеется в ДНК штамма 1, что приводит к исчезновению соответствующей полосы продукта ПЦР на электрофореграмме; б – результаты амплификации ДНК, содержащей сайты связывания праймеров постоянной локализации. ДНК штаммов 2 и 3 содержат делеции разной длины между сайтами связывания праймеров. Альтернативно, ДНК штаммов 1 и 2 могут содержать вставки, отсутствующие у ДНК штамма 3. Это находит отражение в длинах продуктов ПЦР, разделяемых электрофорезом. А, Б – сайты связывания праймеров на ДНК

Генетическое типирование микроорганизмов с использованием праймеров произвольной первичной структуры. Использование коротких олигонуклеотидных праймеров произвольной структуры основано на том, что в больших геномах для них имеются множественные сайты посадки, а следовательно, и инициации ПЦР. Чем короче такие праймеры, тем большее количество сайтов посадки для них должно существовать. Одним из ограничений дальнейшего участия таких праймеров в ПЦР будет расстояние между двумя сайтами посадки для противоположно направленных праймеров. Чем длиннее ПЦР-продукт, который должен образовываться в результате функционирования таких праймеров, тем менее надежно работает вся система типирования. На практике длина образующихся с произвольными праймерами продуктов ПЦР находится в пределах 0,2–2,0 т.п.о.

В зависимости от локализации на ДНК мест посадки для пары коротких праймеров могут образовываться два типа продуктов ПЦР. В первом случае различия в длинах продуктов ПЦР обусловлены присутствием на ДНК типируемых микроорганизмов разного числа сайтов связывания для одного или обоих праймеров (рис. II.35,а ). Во втором случае такие различия определяются длинами сегментов ДНК (ампликонов ), заключенных между парами мест посадки праймеров при неизменном их числе в конкретных генетических локусах (см. рис. II.35,б ). На практике могут одновременно реализовываться обе эти возможности. Во время генетического типирования эукариот указанными методами иногда сразу функционируют до 100 ампликонов, тогда как у бактерий это число достигает лишь 20.

Несмотря на то что при обсуждаемом подходе последовательности праймеров выбираются произвольно, получаемая картина амплификации, как правило, является видо- и штаммоспецифичной. При этом количество сайтов связывания на одной и той же ДНК для праймеров одинаковой длины, но с разной первичной структурой может существенно варьировать. На рис. II.35 показаны такие свойства двадцати 10-нуклеотидных праймеров, испытанных на ДНК человека, бобов и S. aureus. Видно, что использование праймера AGGGGTCTTG, например, приводит к амплификации 8 ампликонов в ДНК человека, 3 ампликонов в ДНК соевых бобов и не выявляет ни одного ампликона в ДНК S. aureus, тогда как при использовании праймера AATCGGGCTG удается обнаруживать до 40 ампликонов в ДНК человека и соевых бобов и до 20 ампликонов в бактериальной ДНК. Таким образом, при использовании обсуждаемого метода в ДНК-типировании самым важным этапом является подбор праймеров или их комбинаций для наиболее эффективного определения принадлежности организма к тому или иному виду, штамму или линии.

Генетическое типирование микроорганизмов с использованием геномных фингерпринтов. При другом подходе к генетическому типированию с использованием ПЦР исследуют полиморфизм конкретных локусов, для которых хотя бы частично известна первичная структура. Синтезируют специфические олигонуклеотидные праймеры, сайты связывания которых фланкируют исследуемую последовательность ДНК с длиной 1,5–2,5 т.п.о. После проведения ПЦР особенности первичной структуры продуктов ПЦР определяют с помощью рестрикционного анализа. Положение сайтов рестрикции в анализируемой последовательности нуклеотидов может иметь видо- или штаммоспецифический характер и служить точным генетическим маркером того или иного микроорганизма.

С помощью этого метода, который по своей сути является разновидностью рассмотренного выше способа определения ПДРФ, идентифицируют близкородственные, сходные по фенотипу штаммы возбудителей заболеваний, исследуют генетическую структуру популяций микроорганизмов и механизмы их адаптивной изменчивости.

11.2.2. Идентификация личности на основе минисателлитной ДНК: определение отцовства

Определение отцовства представляет собой серьезную социальную, юридическую и медицинскую проблему. Решение этой задачи часто требуется в судах, при разрешении частных споров, для пренатальной (внутриутробной) диагностики, генетических консультаций и при пересадках органов. Например, только в США в 1990 г. было проведено более 120000 тестов на определение отцовства, и это число быстро возрастает. Мировой рынок таких диагностических тест-систем оценивался в 1994 г. более чем в 1 млрд долларов и сейчас является крупнейшим рынком среди молекулярно-генетических диагностикумов.

С использованием диагностических тест-систем на основе минисателлитных ДНК определение отцовства получило прочную научную основу. С этой целью в настоящее время используют два подхода. При одном из них применяют олигонуклеотидные зонды, специфичные в отношении многих минисателлитных локусов, при другом – наборы зондов (или праймеров), специфичных в отношении отдельных полиморфных локусов VNTR (подробнее о VNTR см. раздел 1.3.1).

Теоретические аспекты возможности определения отцовства. Возможность определения отцовства, так же как и отнесение биологических образцов, содержащих ДНК, к тому или иному человеку, основано на наличии в геноме человека четких генетических маркеров в виде определенных последовательностей ДНК, набор которых уникален для конкретного индивидуума. Теоретически такими маркерами могли бы быть любые последовательности нуклеотидов ДНК, для которых характерна большая изменчивость в популяциях человека. Как было уже отмечено выше, тандемно повторяющиеся последовательности минисателлитов (VNTR) являются одними из наиболее полиморфных последовательностей нуклеотидов в геноме человека. Поэтому неудивительно, что именно они были использованы для идентификации личности. Наличие сочетания генетических маркеров среди VNTR, общих для мужчины, женщины и спорного ребенка, в ряде случаев может однозначно указывать на родственные связи между ними.

Отсутствие общих генетических маркеров у обследуемых ребенка и мужчины однозначно исключает последнего как отца ребенка. Однако обнаружение у них общих маркеров еще не может быть доказательством того, что подозреваемый мужчина является отцом. Доказательства отцовства основываются на простых статистических расчетах, в которых учитываются частоты встречаемости в популяции общих аллелей исследуемых VNTR-локусов. Рассчитывается отношение (X/Y) вероятности (X) получения наблюдаемого набора маркеров возможного настоящего отца к вероятности (Y) обнаружения этого набора маркеров у любого, выбранного наугад человека, принадлежащего этой популяции. Такое отношение вероятностей получило название индекса отцовства (paternity index – PI).

При расчетах PI возникает еще одна проблема, связанная с определением вероятности (X) того, что обследуемый мужчина является отцом. Значение такой вероятности необходимо иметь до проведения каких-либо диагностических тестов. Обычно используемое значение 0,5 нельзя считать достаточно обоснованным во всех конкретных случаях. К счастью, при очень больших значениях PI (>10 4), которые обычно получаются при таких исследованиях ДНК, выбор этой исходной вероятности оказывается практически несущественным. Как правило, это получается вследствие низких значений вероятности Y.

Определение отцовства с использованием олигонуклеотидных зондов, специфичных в отношении нескольких VNTR-локусов. В 1985 г. И.О. Джеффрисом и соавторами впервые было показано, что олигонуклеотидные зонды, комплементарные последовательностям миоглобинового гена человека, одновременно обладают способностью гибридизоваться по Саузерну с множественными локусами минисателлитной ДНК. Профили гибридизации оказались специфичными для отдельных индивидуумов. Совокупность электрофоретически разделяющихся рестрикционных фрагментов анализируемой ДНК, выявляемых после проведения гибридизации с мечеными зондами, которые специфичны в отношении полиморфных минисателлитных локусов, получила название ДНК-фингерпринтов, или генетических отпечатков пальцев . С помощью таких и других аналогичных олигонуклеотидных зондов удается выявлять на одной электрофореграмме до 15–20 различных фрагментов ДНК одного индивидуума, молекулярная масса которых превышает 3,5 т.п.о., а также много более мелких фрагментов, которые не учитываются при определении отцовства этим методом.

Рис. II.36. Примеры исключения и доказательства отцовства с помощью ДНК-типирования

Результаты гибридизации по Саузерну с зондом F10 показывают полную идентичность фрагментов ДНК у ребенка и отца (дорожки 2 и 3), что рассматривается как доказательство отцовства, либо выявляют, по крайней мере, 6 дополнительных фрагментов ДНК у ребенка, обозначенных стрелками, которые отсутствуют у отца (дорожки 5 и 6 – исключение отцовства)

На рис. II.36 показаны результаты одного из таких опытов. Интерпретация ДНК-фингерпринтов, полученных при анализе множественных локусов, основана на трех постулатах. Прежде всего, предполагается, что фрагменты ДНК, видимые на фингерпринтах, являются аллельными продуктами отдельных генетических локусов человека и передаются потомству независимо друг от друга. Во-вторых, считается, что для каждого генетического локуса частоты встречаемости в популяции отдельных аллелей следуют нормальному распределению Пуассона. И, наконец, принимается, что фрагменты ДНК, электрофоретическая подвижность которых совпадает, представляют один и тот же аллель конкретного локуса. Накопленный опыт работы с ДНК-фингерпринтами показывает, что первое допущение соблюдается достаточно хорошо: аллелизм (парность гомологичных генов, определяющих разные фенотипические признаки у диплоидных организмов) и генетическое сцепление между исследуемыми локусами наблюдаются редко. Невыполнение второго предположения не сказывается серьезно на результатах тестирования, поскольку выводы делаются без учета частоты встречаемости отдельного аллеля на основе совпадения структуры (фрагментов ДНК) многих локусов. Третий постулат является более спорным, однако его применение придает значениям индекса отцовства стабильность.

С этими исходными условиями статистическая оценка ДНК-фингерпринтов множественных локусов основывается только на одном параметре: средней доле фрагментов ДНК (x ), которые совпадают у людей без родственных связей. Такой параметр в большей степени зависит от техники лабораторных исследований, чем от свойств обследуемой популяции. Это прежде всего способность используемой системы к электрофоретическому разделению индивидуальных фрагментов ДНК (т.е. разрешающая способность используемого метода), принципы выбора конкретных фрагментов ДНК для анализа, а также критерии принятия решения об идентичности сравниваемых фрагментов ДНК. Следовательно, параметр x может варьировать при сравнении результатов, получаемых в разных лабораториях, но эти различия будут постоянно сохраняться для различных популяций и субпопуляций. Действительно, при использовании, например зондов 33.6 и 33.15, оказалось, что x один и тот же у неродственных индивидуумов, в парах муж–жена и в различных этнических группах.

Рис. II.37. Сравнение информативности двух минисателлитных зондов при идентификации личности

Частоты встречаемости минисателлитных локусов D1S7 (а ) и D1S80 (б ) определенного размера в популяции оценивали гибридизацией по Саузерну после расщепления ДНК рестриктазой Hae III (а ) или ПЦР (б ). Для локуса D1S7 характерно квази-непрерывное унимодальное распределение, тогда как локус D1S80 характеризуется меньшей гетерозиготностью (84%) с небольшим числом дискретных аллелей, для которых характерно мультимодальное распределение

Определение отцовства с использованием ДНК-зондов, специфичных в отношении только одного локуса. ДНК-фингерпринты, получаемые при одновременном исследовании многих локусов, отражают скорее фенотип индивидуума, чем его генотип. Действительно, получаемая в итоге картина заключает в себе множество полос ДНК, в том числе и неразделившиеся, а также слабо разделившиеся фракции. Такая электрофореграмма напоминает сложный фенотипический признак, например форму лица человека, которая является результатом экспрессии громадного числа генов. В отличие от этого с помощью ДНК-зондов, представляющих собой клонированные последовательности минисателлитов и взаимодействующих только с одним локусом, можно получать истинную информацию о генотипе изучаемого организма. Таким образом, имея дело с отдельными полиморфными локусами человека, исследователи получают в свои руки систему кодоминантных аллелей (т.е. аллелей, совместно участвующих в формировании фенотипических признаков), наследуемых по законам Менделя. Именно понимание наследования таких минисателлитных локусов и привело к широкому распространению однолокусного метода определения отцовства.

В настоящее время получены сотни клонов минисателлитной ДНК и на их основе разработаны комбинации зондов, пригодные для определения отцовства. При выборе зондов для таких минисателлитных локусов обычно руководствуются следующими критериями: зонды должны обладать строгой локус-специфичностью, а тестируемые локусы быть несцепленными (передаваться потомству независимо друг от друга) и обладать достаточной, но не чрезмерной генетической стабильностью. В частности, среди наиболее широко используемых зондов MS1 (D1S7) соответствует генетическому локусу, гетерозиготному в 99% случаев, однако он мутирует с очень высокой частотой (0,05 на гамету) и поэтому, несмотря на высокую информативность, не используется при определении отцовства (рис. II.37,а ). В то же время для локуса D1S80 со значительно меньшей вариабельностью (84% гетерозигот) характерно образование кластеров в частотах распределения фрагмента ДНК по длине (см. рис. II.37,б ). Поэтому небольшие ошибки в определении длины аллелей могут привести к значительным ошибкам в оценке частоты их встречаемости. Такие локусы достаточно легко изменяются в результате генетического дрейфа и инбридинга.

В настоящее время разработана теория, указывающая на то, сколько локусов должно быть типировано для получения правильного ответа об отцовстве при известных значениях гетерозиготности этих локусов в популяции. Например, если используются локусы, гетерозиготность которых составляет 90%, для установления отцовства необходимо проанализировать шесть таких локусов. В США в настоящее время для этих целей обычно используется набор из трех–пяти однолокусных зондов. Однолокусные зонды обладают низкой разрешающей способностью относительно братьев и сестер (сибсов ). В частности, с помощью одного такого зонда можно лишь с вероятностью 75% обнаружить генетические различия между сибсами, и эта вероятность увеличивается до 99,6% при использовании четырех зондов. Данный факт приобретает особую важность, когда при определении отцовства необходимо сделать выбор между братьями.

Особенности определения отцовства по отдельным локусам с использованием ПЦР. В качестве альтернативы однолокусным зондам в последнее время для определения отцовства часто используют ПЦР. Отдельные мини- и микросателлитные локусы могут быть амплифицированы с помощью праймеров, комплементарных уникальным последовательностям ДНК, фланкирующим эти повторяющиеся последовательности. При идентификации личности метод ПЦР, который по своей сути является одной из разновидностей однолокусной методики, поскольку имеет дело с отдельными локусами, обладает, по крайней мере, двумя преимуществами перед однолокусными зондами. Во-первых, популяционный полиморфизм длин ДНК аллелей, исследуемых с использованием этого метода, носит более дискретный характер, чем у аллелей, изучаемых с помощью однолокусных зондов (см. рис. II.37,а ,б ). Это обстоятельство облегчает последующее вычисление индекса отцовства. Во-вторых, метод ПЦР обладает гораздо большей чувствительностью и может быть использован при анализе образцов, содержащих <1 нг геномной ДНК и полученных из разных источников (см. раздел 11.1.1).

К недостаткам ПЦР в применении к определению отцовства следует отнести низкую информативность полиморфных микросателлитов и коротких минисателлитов. Это связано с тем, что они обладают <90% гетерозиготности, небольшим числом аллелей и имеют тенденцию к образованию кластеров по размерам (см. рис. II.37,б ). Кроме того, на распределение таких последовательностей в геноме оказывают влияние инбридинг и принадлежность индивидуумов к определенным этническим группам. Количество локусов минисателлитов, которое необходимо исследовать методом ПЦР для определения отцовства, приближается к 11, а микросателлитов – к 18.

Для типирования с помощью ПЦР наиболее часто используются три минисателлитных локуса человека: в гене аполипопротеина B (APOB), D17S5 (известный также как локус D17S30) и D1S80. Все три локуса легко амплифицируются (максимальный размер их аллельных вариантов не превышает 1 т.п.о.) и легко обнаруживаются с помощью электрофореза. Однако для них характерны низкий уровень гетерозиготности и малая изменчивость (что выражается в небольшом числе известных аллелей). Мутации в этих микросателлитах возникают очень редко.

Одним из путей повышения информативности полиморфизмов микросателлитов при ДНК-типировании является одновременная амплификация двух тесно сцепленных микросателлитных локусов, сочетания которых формируют множество гаплотипов . Например, одновременная амплификация двух GATA-повторов, локализованных в интроне 40 гена фактора фон Виллебранда, которые разделены последовательностью длиной в 212 п.о., обнаружила суммарный уровень гетерозиготности объединенного локуса ~93%. При этом уровни гетерозиготности индивидуальных локусов составляли лишь 72 и 78% соответственно.

В заключение необходимо еще раз отметить, что по своей логике современные методы определения отцовства, основанные на ДНК-типировании, несколько противоречивы. Если отрицательное заключение об отцовстве, основанное на несовпадении аллелей анализируемых мини- или микросателлитных локусов, абсолютно и не подлежит сомнению, то положительный вывод может быть сделан лишь с некоторой долей вероятности, которая основана на частоте встречаемости конкретных аллелей анализируемых локусов в популяции. С другой стороны, в результате методических ошибок легко могут быть сделаны ложноотрицательные выводы, однако положительное заключение об отцовстве в результате лабораторной методической ошибки практически исключено.

Высокая информативность многолокусных ДНК-фингерпринтов подтверждена большим числом генетических и популяционных исследований. Эмпирические данные, полученные при обследовании тысяч семей, показали, что с помощью многолокусных зондов можно разрешать все спорные случаи отцовства. Использование однолокусных зондов затруднено невозможностью создания полной классификации соответствующих аллелей в популяции из-за кажущегося непрерывного распределения их по размерам. Однако и в этом случае на практике проблема полностью решается с помощью набора из пяти–шести однолокусных зондов. Применение ПЦР ограничивается большой эволюционной консервативностью амплифицируемых мини- и микросателлитных локусов и, как следствие, малым суммарным числом аллелей. Однако ПЦР бывает очень полезна на первых этапах исследования из-за методической простоты постановки опытов, особенно в условиях малой доступности исходного биологического материала. Все три группы методов хорошо дополняют друг друга и в разных сочетаниях в спорных случаях позволяют однозначно идентифицировать личность человека.

Результаты, полученные при исследовании структуры и организации геномной ДНК животных, растений и микроорганизмов, наложили глубокий отпечаток на методологию их систематизации. Проблема адекватного отнесения конкретного организма к той или иной группе не является чисто академической. Основанная на точных критериях систематика живых организмов, определяющая эволюционное родство между ними, помимо чисто теоретического представляет и большой практический интерес. В частности, знание источника различных штаммов патогенных микроорганизмов, вызывающих больничные инфекции, позволило бы выработать эффективные меры защиты против их распространения.

Недавно были обнаружены генетические маркеры в виде специфических последовательностей ДНК, которые дают возможность выявлять родственные отношения между особями одного и того же вида путем внутри- и межпопуляционных исследований. Такого рода исследования популяций человека особенно важны с практической точки зрения. В настоящее время молекулярно-генетические методы позволяют осуществлять идентификацию личности в судебно-медицинских исследованиях, а также решать в спорных случаях проблему определения отцовства.

Генетическим, или ДНК-типированием, называют определение особенностей генотипа организма путем анализа ДНК его генома. Иными словами, в процессе ДНК-типирования определяют особенности первичной структуры ДНК исследуемого организма в конкретных генетических локусах. Абсолютно консервативных генетических локусов, по-видимому, не существует. Мутационные изменения генома непрерывно накапливаются на протяжении филогенетического (исторического, эволюционного) развития вида. Но такого же рода изменения неуклонно происходят в геномах отдельных особей, принадлежащих одной или разным популяциям. Естественно, что проще всего обнаруживаются межвидовые различия в последовательностях нуклеотидов исследуемых участков генома, поскольку эти различия, как правило, значительны, и именно они определяют эволюционное расстояние между видами (их дивергированность ).

Таким образом, у каждого вида организмов имеется большое число внутривидовых различий в первичной структуре ДНК отдельных генетических локусов. Генетические локусы, выполняющие одну и ту же функцию (содержащие один и тот же ген или несколько генов), но различающиеся по первичной структуре ДНК, называют полиморфными , а само явление существования в популяции полиморфных локусов получило название генетического полиморфизма .

Днк-типирование микроорганизмов

Рис. II.35. Схема ДНК-типирования микроорганизмов с использованием ПЦР и праймеров произвольной структуры

а – штаммоспецифические различия, обусловленные разной локализацией участков ДНК, взаимодействующих с праймерами. В ДНК штаммов 2 и 3 отсутствует участок, который имеется в ДНК штамма 1, что приводит к исчезновению соответствующей полосы продукта ПЦР на электрофореграмме;б – результаты амплификации ДНК, содержащей сайты связывания праймеров постоянной локализации. ДНК штаммов 2 и 3 содержат делеции разной длины между сайтами связывания праймеров. Альтернативно, ДНК штаммов 1 и 2 могут содержать вставки, отсутствующие у ДНК штамма 3. Это находит отражение в длинах продуктов ПЦР, разделяемых электрофорезом. А, Б – сайты связывания праймеров на ДНК

➜ Ко всем анализам

Стоимость:

*без учета забора материалов

Срок выполнения (раб.дн.)

Время сдачи**

Весь день по графику работы медцентра

Методика

не обнаружено

Материал

урогенитальный соскоб

** График сдачи и условия подготовки актуальны только для данного анализа. Если необходимо сдать несколько анализов - рекомендуем уточнить график и условия по телефону колл-центра.

*** Обращаем ваше внимание, что сроки выполнения анализов могут быть увеличены по техническим причинам, связанным с особенностями биоматериала (гемолизированные, хилезные образцы, наличие сгустков и т.д.), что требует перестановок, а в некоторых случаях повторного забора материала.

Номенклатура

Human papillomavirus, HPV, вирус папилломы человека, ВПЧ

Описание

ВПЧ - наиболее часто встречающаяся инфекция, передаваемая половым путем. Преимущественно поражает эпителий, стимулирует его разрастание и приводит к образованию кондилом, бородавок, эрозиям. Известно более 100 типов вируса папилломы. Возможно носительство одновременно нескольких типов вируса у одного человека.

Некоторые типы вируса (онкогенные) при встраивании в геном клеток эпителия (интеграция) могут вызывать их злокачественное перерождение, приводя к раку. Самым опасным считается носительство ВПЧ 16 и 18 типов, поскольку оно с высокой долей вероятности приводит у женщин к развитию рака шейки матки.

Способ передачи

Контактный (при генитально-генитальных, генитально-оральных, генитально-анальных контактах), вертикальный (от матери ребенку), бытовой.

Инкубационный период

Составляет от нескольких недель до нескольких лет.

Особенности теста

Анализ инфекции с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет проводить чувствительное и специфичное определение наличия возбудителя, а также определяет его типы.

Даже если две раковые клетки выглядят под микроскопом одинаково, они могут быть очень разными, потому что в них произошли разные мутации, у них различается молекулярно-генетический профиль. За счет этого они будут по-разному себя вести и неодинаково реагировать на одно и то же лекарство.

Генетическое типирование помогает составить «молекулярный портрет» опухоли, подобрать наиболее эффективные препараты, назначить оптимальную схему лечения для конкретного случая. Такой подход не просто позволяет выиграть драгоценное время, он помогает сделать лечение персонализированным, повышает шансы на успех при разных видах рака.

При помощи современных технологий можно проанализировать большинство лекарственных препаратов и наиболее распространенные онкозаболевания. В итоге врач понимает, какое лечение принесет наилучший эффект у конкретного пациента.

Тест OncoDEEP - это комплексное молекулярно-генетическое исследование, в котором сочетаются самые современные технологии: Секвенирование Следующего Поколения (NGS) ИГХ, FISH, анализ метилирования, транслокаций, и многое другое. Материал для исследования получают при помощи классической (образец ткани опухоли) или жидкостной (образец крови) биопсии.
OncoDEEP позволяет определить чувствительность опухоли к разным видам терапии и подобрать персонализированное лечение, сопоставив результаты с данными мировой литературы и доказательной базы.

В настоящее время генетическое типирование успешно применяют для подбора лечения при меланоме, раке молочной железы, толстой и прямой кишки, яичников, легкого, а также при ряде других онкозаболеваний.

Мы помогаем онкологам и химиотерапевтам составить максимально эффективный план лечения посредством трехэтапной диагностики:

биопсия опухоли;
анализ крови;
подключение к платформе обработки и анализа данных, получаемых от врачей и пациентов со всего мира.

Данная платформа позволяет получить персонифицированное заключение, в котором отражена взаимосвязь терапии и генного ответа как реакции на назначенное лечение. Это дает врачу возможность быстро получать обратную связь и менять протокол в соответствии с полученной информацией.

Молекулярно-генетическое типирование помогает:

повысить эффективность химиотерапии и таргетной терапии;
более точно прогнозировать поведение опухоли и процесс метастазирования;
сэкономить время.

Для кого предназначено генное типирование?

Для взрослых пациентов с обширным опухолевым процессом всех типов. Метод помогает повысить эффективность терапии в следующих случаях:

если лечение уже проводилось, но не дало результатов;
при метастатических опухолях;
при редких, агрессивных типах рака.

Какие технологии применяются?

Исследование проводится на одном из двух видов препаратов:

FFPE-блоки - фиксированные в формалине и парафинизированные образцы тканей;
Микропрепараты - предметн6ые стекла с образцами ткани.

В медицинском центре «Медицина 24/7» есть оборудование, которое позволяет проводить все необходимые исследования с использованием новейших технологий биосеквенирования в сочетании с иммуногистохимическим исследованием и анализом биомаркеров, специфичных для данного вида опухоли.