Основными методами цитологических исследований являются световая и электронная микроскопия , т. е. использование световых и электронных микроскопов, позволяющих увидеть внешнее и внутреннее строения клеток.
Световые микроскопы позволяют в том числе наблюдать и за живыми клетками (обычно для этого используются одноклеточные организмы, клетки крови). Однако разрешающая способность световых микроскопов не так велика как у электронных. Разрешающая способность увеличительного прибора - это минимальное расстояние между двумя видимыми отдельно точками. У световых микроскопов это расстояние измеряется сотнями нанометров, а у электронных - десятками и единицами нанометров. Если в первых используется световой поток (разрешающая способность обратнопропорционально зависит от длины волны), то во вторых - поток электронов.
Существует два вида электронных микроскопов - просвечивающие и сканирующие. Разрешающая способность первых несколько выше, однако с помощью вторых можно получить объемное изображение. Для просвечивающих микроскопов готовят очень тонкие срезы, через которые проходит пучок электронов. В сканирующих микроскопах пучок электронов отражается от объекта.
В цитологических исследованиях также используется метод флуоресцентной микроскопии , который заключается в том, что к живым клеткам добавляются определенные красящие вещества, которые, соединяясь с различными компонентами клетки, начинают светиться. Таким образом, можно в световой микроскоп наблюдать клеточные структуры (хлоропласты, микротрубочки и др.).
Кроме микроскопии в современной цитологии используются и другие методы исследования. Цитохимический метод позволяет изучать химический состав клеток. Данный метод базируется на химических реакциях определенных веществ. Добавляя реагенты к клеткам, можно выявить наличие в них ДНК, определенных белков и др., а также определить их количество.
Метод радиоавтографии предполагает введение вещества, содержащего меченые (радиоактивные) атомы. Меченые молекулы через некоторое время включаются в биополимеры клетки, и по ним можно отследить протекание метаболических процессов в клетке.
С 20-х годов XX века хорошо известен такой метод цитологических исследований как центрифугирование (или метод фракционирования клеточных структур) . Он основан на том, что клеточные структуры имеют разную массу и при центрифугировании осаждаются с разной скоростью. Таким образом, если разрушить клетки, то после центрифуги смесь разделится на фракции, где внизу будут находиться более тяжелые структуры (обычно это клеточные ядра), а вверху - более легкие.
Относительно новым является метод клеточных культур , позволяющий вне организма в специально созданных условиях выращивать одинаковые клетки (колонии) из одной или нескольких исходных. Данный метод позволяет отдельно от организма изучать свойства его клеток, проводить цитологические, генетические и другие исследования.
Новым методом цитологических исследования является метод микрохирургии . С помощью микроманипулятора, соединенного с микроскопом, из клеток извлекают или вносят различные компоненты, вводят вещества.
Клеточный уровень организации жизни
§ 16. История изучения клетки. Методы цитологических исследований.
История изучения клетки.
Мир клеток оставался полностью неизвестным до середины XVII в., пока люди не научились шлифовать линзы и использовать их для расширения возможностей зрения.
Одним из первых создателей микроскопа был Роберт Гук физик, метеоролог, биолог, инженер, архитектор. В 1665 г. он издал альбом рисунков под названием «макрография», в котором были представлены его наблюдения под микроскопом.
Одним из одаренных современников Гука был голландец Антони ван Левенгук, который создал 200 микроскопов собственной особой конструкции. Левенгук добился увеличения объектов в 270 раз и сделал выдающиеся открытия.
Роберт Броун в 1833 г. открыл в клетке ядро. После 1825 г. Ян Пуркинье разработал эффективные методики приготовления и окраски препаратов для микроскопической техники.
Клеточную теорию предложил для растений в 1837 г. немецкий ботаник Матиас Шлейден, а распространил на животный мир его друг, физиолог Теодор Шванн. Несколько позже ее дополнил Рудольф Вирхов, который в 1885 г. сформулировал положение «Каждая клетка происходит из клетки».
В середине XIX в. клеточная теория стала общепризнанной и основой для науки о клетке - цитологии. К концу XIX в. было открыто много компонентов клеток. Ученые описали их и дали им названия.
Но в 1945 г. цитологи впервые заглянули в клетки с помощью электронного микроскопа и увидели много неизвестных ранее структур. Итак, решающая роль в развитии цитологии принадлежит новым открытием в других науках, в частности в физике.
Методы цитологических исследований.
Основным методом является метод световой микроскопии. Он предусматривает применение светового микроскопа, но рассмотреть под световым микроскопом можно только специально приготовленные цитологические препараты.
Для приготовления препаратов цитологи используют предметные стекла и специально подготовленные объекты, которые можно рассматривать.
Чаще всего эти структуры бесцветные, поэтому их необходимо красить специальными красителями, каждый раз разными, в зависимости от того, какие структуры желательно увидеть.
Существуют два метода: метод приготовления давлений препаратов - исследуемый объект просто раздавливается в один слой между предметным и накрывным стеклом, и метод приготовления тонких срезов, состоящие из одного слоя клеток.
Для изучения живых клеток применяют метод фазово-контрастной микроскопии. Он базируется на том, что отдельные участки прозрачной клетки отличаются друг от друга по плотности и светопреломления.
Изучая живые клетки, применяют также метод флуоресцентной микроскопии. Смысл его заключается в том, что целый ряд веществ обладают способностью светиться при поглощении ими световой энергии. Например, если в флуоресцентный микроскоп рассматривать клетки растений, то на темно-синем теле будет видно красные зерна, ярко светятся, - это хлоропласты.
Существует метод, в котором используются меченые изотопы - метод авторадиографии - регистрации веществ, меченных изотопами. С помощью этого метода можно увидеть, к каким частям клетки попадают вещества, меченные радиоактивными изотопами.
Метод электронной микроскопии открыл цитолог те структуры клетки, которые имеют размеры, меньше длины световой волны. Благодаря этому методу появилась возможность рассмотреть вирусы и органеллы, на которых происходит синтез белка (рибосомы).
Цитологи могут также получать и изучать различные компоненты клеток с помощью фракционирования клеток. Клетку сначала разрушают, а затем выделяют клеточные структуры, используя специальное устройство - центрифугу.
Метод использования культуры клеток является методом длительного хранения и выращивания в специальных питательных средах клеток, тканей, небольших органов или их частей, выделенных из организма человека, животного или растения. Важным преимуществом этого метода является возможность наблюдения за жизнедеятельностью клеток с помощью микроскопа.
Значение цитологических методов в диагностике и лечении заболеваний человека.
1) Цитологические методы применяются в медицине для исследования физиологического состояния организма человека на основе изучения строения клеток. Они используются для выявления заболеваний крови, распознавания злокачественных и доброкачественных опухолей, многих заболеваний органов дыхания, пищеварения, мочевыделения, нервной системы и их лечение.
2) Стволовая клетка - это незрелая клетка, способная к самообновлению и развитию в специализированные клетки организма. Во взрослом организме стволовые клетки содержатся в основном в костном мозге и в очень небольшом количестве во всех органах и тканях. Их можно использовать для лечения многих заболеваний.
§ 17. Строение клеток прокариот и эукариот.
Единство строения клеток.
Содержание любой клетки отделен от внешней среды особой структурой - плазматической мембраной (плазмалемма). Эта обособленность позволяет создавать внутри клетки совсем особая среда, не похоже на то, что его окружает. Поэтому в клетке могут происходить те процессы, которые не происходят нигде, их называют процессами жизнедеятельности.
Внутренняя среда живой клетки, ограниченное плазматической мембраной, называется цитоплазмой. Она включает гиалоплазму (основную прозрачную вещество) и клеточные органеллы, а также различные непостоянные структуры - включения. К органелл, которые есть в любой клетке, относятся также рибосомы, на которых происходит синтез белка.
Строение клеток эукариот.
Эукариоты - это организмы, клетки которых имеют ядро. Ядро - это самая органеллы эукариотической клетки, в которой хранится и из которой переписывается наследственная информация, записанная в хромосомах. Хромосома - это молекула ДНК, интегрированная с белками. В ядре содержится ядрышко - место, где образуются другие важные органеллы, участвующих в синтезе белка - рибосомы. Но рибосомы только формируются в ядре, а работают они (т.е. синтезируют белок) в цитоплазме. Часть из них находится в цитоплазме свободно, а часть прикрепляется к мембран, образуют сетку, которая получила название эндоплазматической.
Рибосомы - немембранни органеллы.
Эндоплазматическая сеть - это сеть канальцев, ограниченных мембранами. Существует два типа: гладкая и гранулярная. На мембранах гранулярной эндоплазматической сети расположены рибосомы, поэтому в ней происходит синтез и транспортировки белков. А гладкая эндоплазматическая сеть - это место синтеза и транспортировки углеводов и липидов. На ней рибосом нет.
Для синтеза белков, углеводов и жиров необходима энергия, которую в эукариотической клетке производят «энергетические станции» клетки - митохондрии.
Митохондрии - двомембранни органеллы, в которых осуществляется процесс клеточного дыхания. На мембранах митохондрий окисляются органические соединения и накапливается химическая энергия в виде особых энергетических молекул (АТФ).
В клетке также есть место, где органические соединения могут накапливаться и откуда они могут транспортироваться, - это аппарат Гольджи, система плоских мембранных мешочков. Он участвует в транспортировке белков, липидов, углеводов. В аппарате Гольджи образуются также органеллы внутриклеточного пищеварения - лизосомы.
Лизосомы - одномембранни органеллы, характерные для клеток животных, содержат ферменты, которые могут расщеплять белки, углеводы, нуклеиновые кислоты, липиды.
В клетке могут быть органеллы, не имеющие мембранной строения, например рибосомы и цитоскелет.
Цитоскелет - это опорно-двигательная система клетки, включает микрофиламенты, реснички, жгутики, клеточный центр, который производит микротрубочки и центриоли.
Существуют органеллы, характерные только для клеток растений, - пластиды. Бывают: хлоропласты, хромопласты и лейкопласты. В хлоропластах происходит процесс фотосинтеза.
В клетках растений также вакуоли - продукты жизнедеятельности клетки, являющиеся резервуарами воды и растворенных в ней соединений. В эукариотических организмов относятся растения, животные и грибы.
Строение клеток прокариот.
Прокариоты - одноклеточные организмы, в клетках которых нет ядра.
Прокариотические клетки малы по размерам, сохраняют генетический материал в форме кольцевой молекулы ДНК (нуклеоидом). В прокариотических организмов относятся бактерии и цианобактерии, которые раньше называли сине-зелеными водорослями.
Если в прокариот происходит процесс аэробного дыхания, то для этого используются специальные выпячивание плазматической мембраны - мезосомы. Если бактерии фотосинтезирующие, то процесс фотосинтеза происходит на фотосинтетических мембранах - тилакоидов.
Синтез белка в прокариот происходит на рибосомах. В прокариотических клетке мало органелл.
Гипотезы происхождения органелл эукариотических клеток.
Прокариотические клетки появились на Земле раньше, чем эукариотические.
1) симбиотические гипотеза объясняет механизм возникновения некоторых органоидов эукариотической клетки - митохондрий и фотосинтезирующих пластид.
2) Инвагинацыонная гипотеза - утверждает, что происхождение эукариотической клетки исходит из того, что предковой формы был аэробный прокариот. Органеллы в нем возникли в результате впячивания и отслоение частей оболочки с последующей функциональной специализацией в ядро, митохондрии, хлоропласты других органелл.
§ 18. Клеточные мембраны. Транспортировки веществ через мембраны. Поверхностный аппарат клетки, его функции.
Клеточные мембраны.
Биологические мембраны - это тонкие смежные структуры молекулярных размеров, расположенные на поверхности клеток и субклеточных частей, а также канальцев и пузырьков, пронизывающих протоплазму. Функция биологических мембран - регулирование транспортировки ионов, сахаров, аминокислот и других продуктов обмена веществ.
В основе любой мембраны лежит двойной слой фосфолипидов.
Однако билипидный слой - это еще не готова мембрана, а лишь ее основа. С билипидного слоем должны связаться белки, называемые мембранными белками. Именно мембранные белки определяют многие свойства мембран. Входят в состав мембран и углеводы, образуют комплексы с белками или липидами. Мембрана состоит из слоя билипидив, в котором плавают (или закреплены) белковые молекулы, образуя в нем своеобразную мозаику.
Строение мембраны соответствует ее функциям: транспортной, барьерной и рецепторной.
1) Барьерная функция. Мембрана является барьером, который предотвращает поступление в клетки различных химических веществ и других агентов.
2) Рецепторные функции. Поверхность мембраны имеет большой набор рецепторов, делающих возможными специфические реакции с различными агентами.
3) Транспортная функция. Через мембрану идет транспорт ионов и веществ.
Покрывая клетку и отделяя ее от окружающей среды, биологические мембраны обеспечивают целостность клеток и органелл. Она поддерживает неравномерное распределение ионов калия, натрия, хлора и других ионов между протоплазмой и окружающей средой.
Особенно важной мембраной в клетке является плазмалемма - поверхностная мембрана. Она выполняет барьерную, транспортную, рецепторную, сигнальную функции.
Транспортировки веществ через мембраны.
Существуют два активных процесса: экзоцитоз и эндоцитоз.
Из клетки вещества выводятся с помощью экзоцитоза - слияние внутриклеточных пузырьков с плазматической мембраной. В клетку вещества могут попадать посредством эндоцитоза. В процессе эндоцитоза плазматическая мембрана образует вогнутости и вырасти, которые потом, отслаивая, превращаются в пузырьки или вакуоли.
Различают два типа эндоцитоза:
- Пиноцитоз - поглощение жидкости и растворенных веществ с помощью небольших пузырьков;
- Фагоцитоз - поглощение крупных частиц, таких как микроорганизмы или остатки клеток.
В случае фагоцитоза образуются большие пузыри, которые называются вакуолями.
Молекулы проходят через мембраны благодаря процессам: простой диффузии, облегченной диффузии, активному транспортировке.
Простая диффузия - это пример пассивного транспортировки, проходит из зоны с большей концентрацией молекул в зону с меньшей концентрацией. Путем простой диффузии в клетку проникают неполярные (гидрофобные) вещества, растворимые в липидах, и мелкие незаряженные молекулы (например, вода). Однако большинство веществ переносится через мембрану с помощью погруженных в нее транспортных белков. Различают две формы обращения: облегченная диффузия и активное транспортировки.
Облегченная диффузия обусловлена градиентом концентрации, и молекулы движутся согласно этому градиента. Однако молекула заряжена, то на ее транспортировку влияет как градиент концентрации, так и мембранный потенциал.
Активное транспортировки - это перенос растворенных веществ против градиента концентрации с использованием энергии АТФ. Энергия необходима потому, что вещество должно двигаться, вопреки своему естественному стремлению двигаться по диффузией, в противоположном направлении. Примером может служить натрий-калиевый насос. По законам диффузии ионы Nа постоянно движутся внутрь клетки, а ионы К + - из клетки. Нарушение необходимой концентрации этих ионов влечет за-гибель клетки.
Поверхностный аппарат клетки.
Разновидность клеток прокариот и эукариот состоит из частей: поверхностного аппарата, цитоплазмы, ядерного аппарата.
Поверхностный аппарат клетки выполняет три функции, универсальные для всех видов клеток: барьерную, транспортную, рецепторную. Он может осуществлять и ряд специфических функций (например, механическая тургорного функция клеточной стенки в растительных клетках). Поверхностный аппарат клеток состоит из систем: плазматической мембраны, надмембранный комплекса и субмембранного (т.е. пидмембранного) опорно-сократительного аппарата.
Плазматическая мембрана, или плазмалемма, - это основная, универсальная для всех клеток система поверхностного аппарата. Под ней расположена субмембранна система, которая участвует в трансмембранному транспортировке и рецепции и является частью цитоплазмы.
Надмембранная структура поверхностного аппарата осуществляют взаимодействие клеток с внешней средой или с другими клетками. У клеток животных надмембранный комплекс, или гликокаликс, играет важную роль в рецепторной функции клеток. Гликокаликс состоит из углеводов, он сравнительно тонкий и эластичный.
К производным надмембранным структурам принадлежит клеточная стенка. Ее должны клетки растений, грибов и бактерий. Клеточная стенка растений содержит целлюлозу, грибов - хитин, бактерий - муреин. Она достаточно жесткая, не сжимается. Через клеточную стенку проходит вода, соли, молекулы многих органических веществ. Явление плазмолиза и деплазмолиза в клетках растений.
Плазмолиз - это отделение цитоплазмы от оболочки при погружении клетки в гипертонический, т.е. концентрированные извне, раствор. Если животные клетки погрузить в гипертонический раствор, то они сжимаются. Иногда плазмолизованые клетки остаются живыми. Если погрузить такие клетки в воду, в которой концентрация солей ниже, чем в клетке, происходит деплазмолиз.
Деплазмолиз - это возвращение цитоплазмы клеток растений из состояния плазмолиза в исходное состояние.
В настоящее время в медицине широко используют цитологические методы исследования и цитологическую диагностику для распознавания многих заболеваний.
Цитологическая диагностика базируется на исследовании микроскопической картины препарата, содержащего как отдельные клетки, так и клетки в составе ткани, а также клеточного окружения в норме и при различных патологических процессах.
Врачи-цитологи проводят профилактические исследования, ставят предварительные диагнозы и дают оценки результатов лечения.
Применяются цитологические исследования в онкологии для распознавания опухолей; в гематологии — для диагностики заболеваний и оценки эффективности их лечения; в гинекологии — с целью диагностики онкологических заболеваний и гормональных нарушений; для распознавания многих заболеваний органов дыхания, пищеварения, мочевыделения, нервной системы и т.д.
Валерий Иванович Ключников работает в должности врача-цитолога в Национальном медико-хирургическом Центре им. Н.И.Пирогова.
"В основном я провожу исследования при помощи микроскопии цитологических мазков, отпечатков, соскобов, материала полученного при биопсии и пункции", - сообщает Валерий Иванович, предоставляя часть результатов своей повседневной работы. «Микрофотографии я получаю, используя тринокулярный Микромед-1, камеру Altami USB 3150 R6 1/2 CMOS (3 Mpix) и программу 2.0.0, с помощью которой удобно проводить измерения элементов».
Рис.1. Железистый эпителий
На рисунке 1 представлена микрофотография железистого эпителия из церквикального канала. Клетки железистого эпителия обведены эллиптическими фигурами.
«Цитологические исследования цервикального канала, то есть шеечного канала матки, проводятся для профилактики предрака и рака шейки матки. На данной микрофотографии виден нормальный железистый эпителий из цервикального канала, но я считаю, что это пример плохо окрашенного мазка. По нему нельзя сделать какие-либо выводы из-за наличия артефактов. Артефакты здесь — рыхлые скопления краски (дефекты окраски мазка). Это мешающие объекты, и иногда они искажают общую картину анализа», - объясняет Валерий Иванович.
Исследование нормального пролиферативного типа мазка показано на рисунке 2 . Мазок был взят с наружной поверхности шейки матки и из цервикального канала (ЦК). «Здесь мы видим поверхностные клетки многослойного сквамозного (чешуйчатого) эпителия (МСЭ) с мелкими ядрами и скопление клеток железистого эпителия из ЦК в виде железистой структуры (полоски) с крупными гиперхромными (плотными) ядрами. В программе Altami Studio было произведено : измерен диаметр такого ядра, и величина его оказалась равной 11.46 мкм», - комментирует Ключников В.И.
Рис. 2. Измерение диаметра ядра железистого эпителия
Микрофотография на рисунке 3 с изображением мазка пролиферативного типа с наружной поверхности шейки матки. «Это нормальный мазок женщины репродуктивного (детородного) возраста. В первой фазе цикла он характеризуется обилием зрелых поверхностных клеток МСЭ. В других случаях данный тип мазка может быть признаком патологии. На микрофотографии видны клетки МСЭ с мелкими ядрами, а также присутствует мелкая палочковая микрофлора», - рассказывает врач-цитолог Валерий Иванович.
Рис. 3. Мазок пролиферативного типа
Микроскопическое исследование мазка пролиферативного типа иногда позволяет диагностировать вирусную природу патологии шейки матки (Рис. 4 ). «На этой микрофотографии я наблюдаю нормальную вагинальную палочковую микрофлору, но увеличение ядер отдельных клеток с образованием околоядерной зоны просветления (койлоцитоз). Это говорит о поражении эпителиальных клеток папиломавирусной инфекцией», - замечает Ключников В. И.
Рис. 4. Папилломавирусная инфекция (ПВИ)
На рисунке 5 представлена микрофотография мазка с наружной поверхности шейки матки женщины в состоянии менопаузы. «Здесь я могу подтвердить диагноз острого воспаления, а именно, атрофического кольпита (вагинита). На это указывает обильное скопление лейкоцитов и увеличение ядра клеток. В Altami Studio был измерен диаметр произвольно выбранного на микрофотографии ядра. Диаметр был равен 14.71 мкм», - отвечает наш респондент.
Атрофический кольпит — симптомокомплекс, имеющий причиной значительное снижение содержания эстрогенов, который приводит к истончению многослойного плоского эпителия.
«Цитологическое исследование является одним из основных методов объективной диагностики атрофического кольпита», - утверждает Валерий Иванович.
Рис. 5. Атрофический кольпит
Помимо гинекологических исследований, Валерий Иванович проводит диагностику узлов щитовидной железы (Рис. 6 ). «На данной микрофотографии мы можем наблюдать нормальные клетки эпителия щитовидной железы (ЩЖ) в массе растворимого, продуцируемого ими, коллоида (уплотненного слизеподобного вещества). Во взятом мазке выражена вакуолизация, то есть разновидность клеточной дистрофии, характеризующаяся образованием в цитоплазме вакуолей. Это говорит о различных нарушениях в обмене веществ клеток, в их функции и строении», - сообщает Валерий Иванович.
Коллоидный зоб ЩЖ - заболевание, развивающееся в результате йододефицита. В качестве профилактики для предотвращения узловых образований достаточно потреблять йод и витамины.
Рис. 6. Преимущественно коллоидный зоб
«Также я исследую мазки, приготовленные из пунктата. Пунктат - это небольшое количество ткани или жидкости, извлеченное путем пункции тонкой иглой. На следующей микрофотографии зафиксировано исследование пунктата из узлового образования ЩЖ (Рис. 7 ).
В данном случае он представляет собой мономорфные (сохраняющие одну форму в течение всего периода развития) мелкие клетки ЩЖ типа А в небольших скоплениях. Наблюдается склонность к образованию микрофолликулярных структур (полоски, розетки), то есть имеется подозрение на аденому.
Мономорфная аденома — это, проще говоря, одиночный, плотный узел, который расположен в глубине железы.
Но не нужно пугаться данного диагноза, аденома щитовидной железы - доброкачественная опухоль и она редко переходит в злокачественную»
Рис. 7. Аденома щитовидной железы
Цитология применяется в том числе и для обследования желудка — по материалам, полученным при эндоскопии (Рис. 8 ). В программе Altami Studio был измерен диаметр ядра клеток эпителия желудка. «Это нормальные клетки эпителия, диаметр одного из самых больших ядер равен 54.7449 мкм», - замечает Ключников В. И.
Рис. 8. Эндоскопический материал из желудка
«Для подсчета элементов крови, их концентрации и определения подвижности я использую камеру Горяева (Рис. 9). Она откалибрована в программе Altami Studio. При помощи камеры Горяева мне удобно определять увеличение микроскопа. Я ее использую исключительно как калибратор».
Рис. 9. Камера Горяева
«Цитология - наука достаточно сложная и, к тому же, субъективная. По этой причине у врача-цитолога должна быть не только соответствующая квалификация, но и большой опыт работы в области цитологии», - делится Валерий Иванович. «Цитологические исследования нужны для д иагностики различных состояний шейки матки, для исследования новообразований щитовидной железы и для других профилактических осмотров. В настоящее время цитологическими исследованиями, получившими признание и широкое распространение, достигаются большие успехи в обеспечении здоровья населения», - считает врач-цитолог Ключников Валерий Иванович.
Клиническая цитология - признанный полноценный метод морфологического анализа, основанный на изучении и оценке клеточного материала, полученного различными способами из патологического очага.
В практической и исследовательской работе привлекает простота, быстрота, легкая повторяемость. Последнее позволяет использовать цитологический анализ для изучения динамики морфологических изменений в течение заболевания и процессе лечения. Кроме того, цитологическое исследование не требует больших материальных затрат, недороги реактивы и оборудование. Все вышеизложенное позволяет широко использовать метод как для морфологической верификации в условиях поликлиники, так. и для проведения массовых профилактических осмотров, выбора групп риска с последующим систематическим наблюдением за лицами входящими в группы риска.
В нашей стране клиническая цитология является разделом лабораторной диагностики и это находит свое объяснение в том, что традиционно исследование клеточного состава входит в комплекс клинических лабораторных анализов - кровь, костный мозг, экссудаты, отделяемое различных органов.
Вместе с тем, в отличие от классических лабораторных методов, которые, как правило, являются количественными, клиническая цитология носит описательный характер. Последнее сближает цитологию с другим морфологическим методом - гистологией.
В связи с этим необходимо отметить, что в США за последние 50 лет клиническая цитология стала ветвью патологоанатомической диагностики и она вошла в обиход 96% патологоанатомических лабораторий.
Известно, что цитологическая картина отражает гистологическое строение и во многом гистологические критерии подходят для оценки цитологических препаратов. При этом следует напомнить, что при описании результатов цитологического исследования используются диагностические, а не количественные термины.
Таким образом, методологически цитологическое исследование существенно отличается от всех других лабораторных методов.
Мощным стимулом к развитию клинической цитологии послужили разработка и совершенствование установок, приборов и инструментов для диагностического обследования.
Необходимость морфологической верификаций способствовало быстрому и значительному росту числа биопсий, в том числе, и преимущественно, пункционных.
И если ранняя клиническая цитология была представлена преимущественно эксфолиативной цитологией: исследование жидкостей - экссудаты, промывные воды; выделений - мокрота, моча; мазков с шейки матки, с поверхности опухоли, то в настоящее время преобладает пункционная цитология. В основном материал для исследования получают посредством пункции опухолевых образований тонкой иглой, пункции под контролем ультразвука, рентгена, компьютерной томографии. Значительную долю исследований в современной клинической цитологии составляют исследования мазков и кусочков, полученных при трепанбиопсии, мазков-отпечатков с операционного и биопсийного материала, мазков щеточкой и соскобы при эндоскопических исследованиях.
В последние годы диагностическая цитология - наиболее быстро развивающийся раздел патоморфологии. Основным диагностическим направлением клинической цитологии является онкоцитология. В конечном счете цитологический анализ производится в первую очередь для того, чтобы получить ответ на вопрос о наличии злокачественного новообразования. В процессе дифференциальной диагностики определяется характер патологического процесса и устанавливаются воспалительные, реактивные, пролиферативные или предраковые поражения, а также доброкачественные опухоли.
Выбор способа взятия материала определяется характером поражения, локализацией, возможностью проведения инструментальных исследований. Желательно использование в комплексе всех доступных методов взятия материала. В частности, при поражениях мочевого пузыря для цитологического исследования может быть использована нативная моча (эффективность цитологической диагностики 40-45%), спиртовый смыв (эффективность цитологической диагностики 60-65%), мазки-отпечатки с кусочков опухоли, взятых при цистоскопии (эффективность цитологической диагностики около 90%). При комплексном обследовании эффективность цитологической диагностики составляет около 100%
Роль морфологических исследований при диагностике опухолей неуклонно возрастает. Лишь детальная морфологическая характеристика новообразования может полностью удовлетворить клиницистов и дать возможность более обоснованно выбрать метод лечения (хирургическое, лучевое, химиотерапевтическое и их комбинации), поскольку опухоли различного строения, происхождения и степени атипии клеток по разному реагируют на терапию.
Как известно, морфологическая диагностика заболеваний отличается наибольшей достоверностью и многие старые и новые методы лабораторной диагностики, имеющие очень большое значение, особенно в совокупности, не могут исключить морфологические методы исследования из клинической практики. Вместе с тем морфологические исследования в клинике приобретают особую значимость, если анализируются в сопоставлении со всеми данными клиники во всем их объеме.
Чтобы максимально обеспечить интересы клиники, интересы конкретного больного человека, морфологический диагноз должен быть предельно точным и объективно отражающим особенности встретившейся онкоморфологической формы.
В настоящее время вопрос об эффективности цитологической диагностики решается однозначно и ценность этого метода в практической деятельности не вызывает сомнений. Цитологический анализ позволяет оценить характер и степень выраженности пролиферации эпителия, выделяя группу дисплазий и на этой основе формировать группы «повышенного риска». Цитологическое исследование позволяет осуществлять наблюдение непосредственно за характером клеточных изменений эпителия у лиц группы «повышенного риска», что фактически невозможно с помощью других морфологических методов.
Несравненные преимущества перед другими методами имеет цитологическое исследование в выявлении рака начальных стадий. Развитие эндоскопической техники, ультразвуковых методов исследования в немалой степени способствовало широкому внедрению цитологического анализа в диагностике новообразований практически из всех тканей организма, в том числе и из внутренних органов ранее недоступных внеоперационному морфологическому анализу.
При распознавании так называемых «ранних раков», цитологический метод имеет нередко преимущества перед другими способами исследования. Свидетельством этому является цитологическая диагностика случаев рака желудка, легкого, мочевого пузыря и других органов при отсутствии клинических, рентгенологических и эндоскопических проявлений, ещё до появления обнаруживаемых этими методами признаков.
Весь опыт существования и постоянного совершенствования клинической цитологии показывает, что цитологическое исследование позволяет с достаточно высокой достоверностью не только констатировать наличие злокачественного новообразования, но и в большинстве случаев определить гистогенез (происхождение, тканевую принадлежность) и степень дифференцировки опухоли. Последнее весьма важно для клиники, т. к. известно, что чувствительность к различным химио- и лучевым воздействиям во многом определяется степенью дифференцировки новообразования. Кроме того, уровень дифференцировки опухоли может быть использован в качестве довольно значимого прогностического показателя.
Такой высокий уровень диагностики позволяет использовать в работе принятые международные морфологические классификации, что чрезвычайно важно, более того, способствует разработке соответствующих цитологических классификаций. В связи с этим следует отметить, что разработка современных цитологических классификаций в соответствии с общепринятыми является одной из неотложных научных и практических задач клинической цитологии.
В настоящее время успехи в обеспечении здоровья населения во многом зависят от проведения массовых профилактических осмотров и в первую очередь групп с повышенным риском различными заболеваниями, особенно злокачественными новообразованиями.
Проведение эффективных массовых профилактических осмотров, как показывает наш опыт и опыт многих стран, невозможен без использования цитологического метода, получившего полное признание и широкое распространение в последние годы. На современном уровне цитологическое исследование является одним из эффективных методов диагностики на любом этапе прогрессии опухоли и в этом плане дает возможность: показать характер и степень выраженности пролиферации клеток; диагностировать злокачественные опухоли при любой локализации в любой стадии процесса.
Ранняя и своевременная диагностика опухолей организационно складывается из двух этапов:
1. Массовое обследование населения (скрининг всей популяции или только групп повышенного риска) для выявления опухолей или признаков, не позволяющих исключить опухоль.
2. Уточняющая диагностика в отобранных во время скрининга сравнительно небольших группах.
На обоих этапах клинической диагностической цитологии принадлежит важная роль, причем использование этого метода характеризуется рядом особенностей.
На первом этапе к цитологическому исследованию как к скрининг-тесту предъявляются особые требования и прежде всего высокая чувствительность (т. е. высокая частота обнаружения клеток опухоли у больных со злокачественными новообразованиями и низкое число так называемых «ложноотрицательных» результатов) при однократном исследовании материала.
Уже доказано, что цитологическое исследование мазков с шейки матки является высокоэффективным скрининг-тестом по раку этой локализации, ибо примерно в 10 раз повышает выявляемость опухолей, по сравнению с визуальной выявляемостью; при этом значительно увеличивается относительная частота обнаружения рака в ранних и доклинических стадиях процесса.
На втором этапе ранней диагностики опухолей, наряду с необходимостью высокой чувствительности, к цитологическому методу предъявляется требование высокой специфичности. Для цитологического исследования на первом этапе высокая специфичность является менее важным показателем, поскольку результаты скрининга всегда проверяются на втором этапе диагностики.
Исследования, осуществляемые с помощью цитологического метода
1. Цитологическое исследование пункционного материала.
Цитологическое исследование пунктатов, полученных тонкой иглой (тонкоигольная биопсия) из опухолей, опухолеподобных образований уплотнений любой локализации: головы, шеи, молочной, щитовидной железы, лимфатических узлов, костей, мягких тканей конечностей, кожи, легких, средостения, органов брюшной полости и забрюшинного пространства,
2. Цитологическое исследование эксфолиативного материала.
Цитологическое исследование секретов, экскретов, отделяемого и соскобов с поверхности эрозий, язв, ран, свищей, мокроты, промывных вод, экссудатов, транссудатов.
3. Цитологическое исследование эндоскопического материала.
Исследование материала, полученного при бронхоскопии, катетеризации бронхов, эзофаго-, гастро-, дуодено-, лаборо-, ректоромано-, колоно-, цистоскопии и других видов эндоскопического обследования при любой локализации патологического процесса.
4. Цитологическое исследование биопсийного и операционного материала
Цитологическое исследование мазков - отпечатков, соскобов с биопсийных кусочков и операционного материала.
Цитохимическое исследование материала - в т. ч. на гликоген, липиды, ДНК, РHК, ферменты и др.
Определение полового хроматина в клетках опухоли.
Цитологическое исследование материала, полученного при профилактических осмотрах населения.
Исследования вагинального эпителия и уроцитограмм с целью определения эстрогенной насыщенности организма с подсчетом формулы созревания, КПИ, ЭИ и др.
Организация работы цитологической лаборатории (ЦЛ)
Функциональные обязанности сотрудников ЦЛ.
Заведующий ЦЛ.
Организует и обеспечивает работу отделения, составляет план работы отделения с распределением обязанностей между, сотрудниками.
Организует и контролирует доставку в лабораторию цитологического материала и результатов исследования из прикрепленных лечебно-профилактических учреждений (за доставку цитологического материала несет ответственность главный врач учреждения, которое направляет материал), при наличии централизованной доставки - главный врач базового учреждения.
Организует и контролирует выезды медицинского персонала в прикрепленные лечебно-профилактические учреждения для срочных цитологических исследований, проведения пункций, консультаций сложных случаев, клинико-биопсийных конференций, обследования цитологических лабораторий.
Отбирает случаи, подлежащие разбору на клинико-биопсийных конференциях, вместе с зам. главного врача по лечебной работе, составляет повестку, участвует в организации проведения клинико-биопсийных конференций (консультирует докладчиков, осуществляет предварительное изучение цитологических препаратов, слайдов и др.).
Проводит ежегодный анализ работы ЦЛ и представляет руководству ЛПУ.
Руководит работой по составлению к постоянному пополнению коллекции микропрепаратов, созданию фототеки музея.
Консультирует врачей клинических отделений по вопросам клинической цитологии.
Организует повышение квалификации врачей и лаборантов. С этой целью организует и проводит периодические и тематические конференции, в т. ч. по исследованию цитологического материала; освоение новых цитологических и цитохимических методик; проводит разбор сложных случаев цитологической диагностики.
Обеспечивает готовность работы отделения при поступлений для цитологического исследования инфекционного материала.
Отвечает за своевременное предоставление заявок на необходимые материалы, реактивы, инструментарий, оборудование, контролирует их расход и использование.
Несет ответственность за соблюдение сотрудниками отделения правил безопасности, противопожаpной безопасности, хранения ядовитых веществ.
Врач-цитолог
проводит цитологическое исследование профилактического, диагностического, гормонального, цитогенетического материала; при необходимости производит срочное цитологическое исследование, участвует в совместной работе с эндоскопистом, хирургом, другими специалистами в получении материала, при необходимости самостоятельно осуществляет пункционные биопсии;
оставляет микропрепараты для архива, фотографирования, демонстрации на клинико-биопсийной конференции;
дает указание лаборанту о способах обработки цитологического материала, методиках окраски, количестве цитологических препаратов;
контролирует качество и сроки выполнения работы лаборантов, оказывает им методическую помощь;
в неясных случаях обсуждает препараты с другими врачами отделения и консультирует с зав. ЦЛ;
проводит микроскопическое исследование цитологического материала, описывает микроскопическую картину и устанавливает цитологический диагноз. При установлении диагноза злокачественной опухоли, тяжелой дисплазии эпителия, процессов, требующих гормональной терапии и хирургического вмешательства, проведения лучевой или цитостатической терапии, результат исследования подписывает зав. ЦЛ;
докладывает зав. ЦЛ о всех недочетах в производственной работе;
осуществляет организационно-методическую работу;
Старший лаборант
организует, обеспечивает и контролирует работу среднего и младшего персонала лаборатории;
ведет графики, начисляет заработную плату, выписывает хим. реактивы, перевязочный материал и др.;
готовит основные растворы хим. реактивов, осуществляет учет и хранение хим. реактивов;
организует учебу среднего, младшего персонала в лаборатории;
помогает зав. отделением в составлении отчетов и заявок на хим. реактивы и оборудование;
следит за санитарно-эпидемиологическим состоянием лаборатории.
Лаборант (фельдшер-лаборант)
осуществляет микроскопические исследования профилактического и гормонального материала;
оформляет документацию для регистрации цитологического материала;
обрабатывает цитологический материал с применением дополнительных методик;
осуществляет срочное изготовление цитологических препаратов;
оформляет выдачи микропрепаратов из архива;
осуществляет уход за приборами и аппаратурой;
готовит хим. реактивы;
участвует в организационно-методической работе по улучшению качества материала;
ежемесячно отчитывается о проделанной работе.
Доставка, регистрация и маркировка материала
Материал для цитологического исследования должен быть доставлен в лабораторию в ближайшие сроки после получения. (жидкость моча, содержимое кист, промины воды экссудаты, мокрота). Мазки, высушенные на воздухе, могут храниться.
Флаконы с материалом и стекла-мазки должны быть маркированы (указана фамилия больного).
В сопровождающем материал направлении должно быть:
фамилия, имя и отчество, пол и возраст больного;
каким образом и откуда получен материал;
в каком виде направляется (жидкость, стекла-мазки), количество;
краткий анамнез с обязательным указанием на наличие и характер вредных воздействий, предшествующего лечения (в особенности гормонального, лучевого, химиотерапии);
данные других методов исследования (рентген, эндоскопия и др.), при подозрении на системное заболевание (гемобластозы) - анализ крови;
описание status localis;
клинический диагноз.
Способы получения и характер материала для цитологического исследования
Материал для цитологического исследования может быть получен различными способами. Прежде всего это:
а) Эксфолиативная цитология , где анализу подвергаются:
отделяемое различных органов (молочная железу бронхи и др.). Для приготовления препарата капля отделяемого наносится на стекло и готовится мазок. Можно также делать отпечатки с места выделения (сосок молочной железы, выходное отверстие свища). Отделяемое бронхов обычно в виде мокроты собирается в сосуд, приготовление препаратов подробно описано в разделе исследования органов дыхания,
жидкости и содержимое кист получают путем пункции полостей (брюшной, плевральной и др.) и кист. Если материала мало, то он наносится на стёкла и распределяется в виде тонкого мазка. Значительные количества жидкости предварительно центрифугируются и затем мазки готовят из осадка. Таким же образом обрабатывается материал промывных вод,
отпечатки со слизистых и кожных покровов, если это доступно, можно делать непосредственно на стекло. В других случаях мазки готовят из соскобов шпателем, с тампонов.
Для исследования эксфолиативного материала в гинекологии существуют отработанные методики, описание которых - в соответствующем разделе.
б) Пункционная цитология - один из наиболее частых видов исследования в клинической цитологии.
Пункция опухолевых образований производится, как правило, тонкой иглой. Для проведения аспирационной биопсии необходим определенный навык. Кроме того, для получения полноценного материала необходимо соблюдать ряд условий. В частности, игла и шприц для пункции должны быть сухими. Не следует проводить предварительную анестезию (введение новокаина). Для пункции богато васкулизированных образований (щитовидная железа, сосудистые опухоли, кость и др.), необходимо использовать иглу с мандреном, последний извлекается после введения иглы в место, из которых предполагается получить материал. Таким же образом, соблюдая вышеописанные правила и используя специальные приспособления, осуществляют пункции под контролем рентгена, ультразвука или компьютерной томографии.
в) Использование для цитологического исследования мазков-отпечатков с биопсийного и операционного материала значительно повышает эффективность цитологической диагностики. Кроме того, морфологическое заключение может быть получено значительно раньше, чем гистологическое Следует отметить исключительную ценность таких параллельных исследований (цитологических и гистологических) в возможности проведения цитогистологических сопоставлений, что в свою очередь существенно обогащает как один, так и другой метод. Для приготовления препарата необходимо соскоб со среза биоптата или операционного материала распределить тонким мазком на стекле. Отпечатки со среза биоптата или кусочка оперативно удаленной ткани наносятся прикосновением поверхности среза к стеклу. Если отпечатки делают с ткани богатой кровью (печень, селезенка и др.), с поверхности среза необходимо снять кровь на фильтровальную бумагу и лишь затем производить отпечатки на стекло.
г) С развитием эндоскопической техники обязательное цитологическое исследование стало более доступным. В современных эндоскопических приборах имеются специальные приспособления для взятия материала на морфологическое исследование. При эндоскопии могут быть получены в частности;
мазки щеточкой,
промывные воды,
мазки тампоном,
мазки - отпечатки щипковых биопсий.
Выбор способа взятия материала определяется характером поражения, локализацией, возможностью проведения инструментальных исследований. Желательно использование в комплексе всех доступных методов взятия материала. В частности, при поражениях мочевого пузыря для цитологического исследования может быть использована нативная моча (эффективность цитологической диагностики 40-50%), спиртовой смыв (эффективность цитологической диагностики 60-65%), мазки-отпечатки с кусочков опухоли, взятых при цистоскопии (эффективность цитологической диагностики около 90%). При комплексном обследовании эффективность цитологической диагностики составляет около 100%
Цитологическое исследование является обязательным компонентом различных клинических методов обследования и необходимо при гинекологическом осмотре брать мазки с шейки матки и из цервикального канала, при подозрении на патологию тела матки-мазки аспирата.
Эндоскопическое исследование:
а) бронхоскопия - мазки щеточкой, трансбронхиальные пунктаты, мазки из материала щипковых биопсий, промывные воды,
б) гастроскопия - мазки щеточкой, отпечатки с щипковых биопсий,
в) колоноскопия, ректоскопия - мазки с ватного тампона, щеточные мазки, отпечатки с биопсий,
г) цистоскопия - нативная моча, спиртовый смыв, отпечатки, с биопсийных кусочков.
д) ларингоскопия - мазки с участков поражения и отпечатки с кусочков,
е) кожа и слизистые оболочки - мазки соскобов с участков поражения, при опухоли - пункция тонкой иглой.
Мягкие ткани, молочная железа, лимфатические узлы, щитовидная железа - пункция тонкой иглой.
Пункция под контролем ультразвука (щитовидная железа, опухоли шеи, печень, селезенка, почка, матки, яичники, предстательная железа, забрюшинные опухоли).
Цитологическому исследованию обязательно должны подвергаться пунктаты серозных полостей, кист, отделяемое из соскоба молочной железы и др.
Стекла для препаратов должны быть чистые, обезжиренные и сухие.
Приготовление стёкол
1. Стекла тщательно промывают щеткой в теплой мыльной (или с моющим средством) воде.
2. Основательно промывают в проточной теплой воде.
3. Затем кипятят 1-2 часа в воде с добавлением соды (2-3%) или моющего средства.
4. После хорошо ополаскивают в чистой горячей воде и промывают в проточной (1-2 часа).