Схема проведения основного опыта реакции Вассермана.

РСК отличается высокой чувствительностью и специфичностью и применяется для:

1) серологической диагностики инфекционных заболеваний (р. Вассермана – при сифилисе, р. Борде–Жангу – при хронической гонорее и др.);

2) идентификации бактерии и др. микробов.

РСК относится к сложным серологическим реакциям, в которых участвуют, кроме АГ и АТ, ещё гемолитическая система (р. гемолиза), выявляющая результат реакции.

РСК проводится в два этапа при участии двух систем:

1) первая система – АГ+АТ+комплемент – обуславливает связывание комплемента в том случае если АТ соответствует АГ. В случае же несоответствия АТ и АГ комплемент остаётся свободным;

вторая система (индикаторная) – гемолитеческая сыворотка (гемолизины) + эритроциты – показывает исход реакции в первой системе: в случае положительного результата реакции в первой системе (образования комплекса АГ+АТ+комплемент) во второй системе не произойдет гемолиза ввиду отсутствия комплемента (эритроциты оседают на дно пробирки). В случае отрицательного результата в первой системе вторая сопровождается гемолизом, т. к. образуется комплекс эритроциты + гемолизины + комплемент (см. прилож. 3, рис.7 и 8).

Компоненты реакции:

1) испытуемая сыворотка (предварительно инактивируют нагреванием при 56 0 С в течение 30 минут);

2) антиген (изготавливается из взвесей убитых микробов, лизатов микробов, полных АГ, гаптенов, экстрактов тканевых липидов);

3) комплемент;

4) гемолитическая сыворотка;

5) 3% взвесь эритроцитов барана;

6) физиологический раствор;

7) контрольная сыворотка.

Комплемент . В качестве комплемента в РСК применяют свежую и высушенную сыворотку морской свинки, т. к. в крови морской свинки комплемент содержится в наибольшем количестве и присутствует постоянно, чем у др. животных. Перед постановкой РСК следует проводить титрование комплемента в реакции гемолиза (эритроциты барана, гемолитическая сыворотка, комплемент, физ. раствор) и определение рабочей дозы.

Титр комплемента – наибольшее разведение комплемента которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии гемолитической сыворотки.

Рабочая доза комплемента – количество комплемента, которое выше тира на 25%.

Гемолитическая сыворотка готовится путём иммунизации кроликов 50% взвесью эритроцитов барана. Полученную сыворотку инактивируют нагреванием при 56 0 С. Определяют титр и рабочую дозу.

Титр сыворотки – максимальное разведение сыворотки которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии комплемента. В качестве рабочей дозы берут гемолитическую сыворотку в тройном титре.

РСК Борде –Жангу

Реакция ставится для диагностики хронической гонореи с целью обнаружения антител к гонококку.

В РСК участвует 2 системы: основная система – испытуемая сыворотка, антиген, комплемент и вспомогательная, индикаторная или гемолитическая система – гемолитическая сыворотка и эритроциты барана.

Если в первой системе образуются специфический комплекс антиген + антитело, то комплемент адсорбируется (соединяется с этим комплексом) и гемолиза во второй системе не происходит.

Для реакции требуется:

1. Испытуемая сыворотка, которая получается из крови, взятой пункцией локтевой вены больного. После свёртывания крови сыворотка отсасывается в отдельную пробирку и инактивируется 30 минут при 56 0 С на водяной бане.

2. Антиген - взвесь убитых гонококков.

3. Эритроциты барана получают из стерильно взятой дефибринированной крови. Их отмывают, центрифугируя 3 раза с новыми порциями физиологического раствора. В реакции используют 3 % взвесь эритроцитов.

4. Гемолитическая сыворотка готовится заранее путём иммунизации кроликов эритроцитами барана. Перед употреблением производится титрование сыворотки.

5. Комплемент - свежая сыворотка морской свинки. Из сердца морской свинки шприцем насасывается кровь, после свёртывания отделяется сыворотка. Перед опытом вытитровывается рабочая доза комплемента. Для этого берут основное разведение комплемента 1:10 и разливают его по пробиркам, от 0,1 до 0,5, после чего объем в каждой пробирке доводят физиологическим раствором до 1,5 мл.

Одновременно заготавливают гемолитическую систему - разведенная в тройном титре гемолитическая сыворотка + 3 % взвесь эритроцитов барана. Оба ингредиента в разных объемах и выдерживают в термостате 30 минут (сенсибилизация смеси), после чего смесь добавляют по 1 мл в пробирки помещают в термостат на 30 минут. Контролем служат 3 пробирки:

1. 1мл гемолитической системы + 1,5 мл физиологического раствора;

2. 0,5 мл комплемента 1:10 + 0,5 мл взвеси эритроцитов + 1,5 мл физиологического раствора.

Титром комплемента называется его минимальное количество, при котором ещё происходит гемолиз. Для постановления реакции берут рабочую дозу комплемента, увеличенную против титра на 20-25 % т. е., обычно то количество комплемента, которое имеется в предпоследней пробирке с гемолизом. Увеличение дозы комплемента необходимо потому, что в реакции активность комплемента может оказаться несколько подавленной другими ингредиентами реакции (антиген, сыворотка).

Постановка основного опыта РСК Борде - Жангу.

В начале в 2 пробирки разливается инактивированная и разведённая 1:5 испытуемая сыворотка. Затем в 1-ю пробирку приливается антиген, во вторую физиологический раствор. После этого во все пробирки добавляются рабочая доза комплемента.

После смешивания ингредиентов штатив с пробирками помещается в термостат при 37 0 С на 30 минут (горячее связывание). При холодном связывании штатив с пробирками помещается в ледник при температуре -4 0 С на 18 часов. После выдерживания в термостате во все пробирки добавляется гемолитическая система. Реакция ставится в объёме 0,5 мл. Пробирки снова помещают в термостат на 2 часа, после чего производится предварительная регистрация результатов. Пробирки остаются при комнатной температуре, а на следующий день отмечается окончательный результат.

Степень интенсивности реакции оценивается в плюсах. Полная задержка гемолиза - четыре плюса (++++), неполная - три, и один плюс. Полный гемолиз обозначается минусами (-).

РСК Вассермана

Ставится для диагностики сифилиса с целью обнаружения антител, а также для определения эффективности специфической терапии. Она основана на принципе реакции связывания комплемента Борде-Жангу. Существенным отличием реакции Вассермана является неспецифичность антигена: в качестве антигена употребляют липоидные экстраты из нормальных органов животных.

Для постановки реакции Вассермана необходимо иметь сыворотку больного, диагностикумы перекрестнореагирующие антигены № 1 и № 2, комплемент, гемолитическую сыворотку, эритроциты барана, физиологический раствор.

Диагностикум № 1 - специфический, трепонемный.

Диагностикум №2 - неспецифический, кардиолипиновый антиген, который представляют собой высокоочищенный экстракт бычьего сердца, имеющий постоянный химический состав липоидов. Липоиды, экстрагированные из сердца, по химическому составу близки к липоидам бледной трепонемы, поэтому хотя и не являются специфическими, но фиксируют антитела против спирохеты. Указанные антигены выпускаются централизованно и в реакцию употребляются, разведёнными согласно к титру, указанному на этикетке.

Одновременно с основным опытом ставят 2 контроля: с заведомо отрицательной и заведено положительной сыворотками.

борде - жангу реакция

Борде Жангу реакция (реакция связывания комплемента, РСК) - иммунологическая реакция, основанная на свойстве комплекса «антиген - антитело» фиксировать свободный комплемент . РСК протекает в две фазы: 1) адсорбция антител на антигенах; 2) выражение реакции в присутствии гемолитической системы (гемолиз). Для постановки РСК изучаемые объекты (антитела и антигены) помещают в условия, обеспечивающие их взаимодействие в присутствии комплемента; затем к анализируемой иммунной системе добавляют «индикатор» - гемолитическую систему. Если комплемент фиксировался иммунной системой, гемолиза не происходит (положительная РСК; рис., а); если же иммунная система не фиксировала комплемент и ее компоненты не соответствуют друг другу, гемолиз происходит (отрицательная РСК; рис., б). Ингредиенты реакции: 1) испытуемая сыворотка, инактивированная прогревом в течение 30 мин. при t° 56°; 2) антиген (взвеси бактерий, экстракты органов и тканей, вирусы); 3) комплемент (свежая сыворотка морской свинки); 4) гемолитическая система (сенсибилизированные эритроциты барана, инкубированные с гемолитической сывороткой в течение 30 мин. при t° 37°). Для разведения ингредиентов используют изотонический раствор хлорида натрия. Первый этап РСК продолжается 60 мин. при t° 37° или 18-20 час. при t° 4-6° (более чувствительная РСК), второй этап - 60 мин. при t° 37°.

В диагностической практике и судебной медицине используют различные модификации РСК - качественные и количественные. См. также Вассермана реакция, Серологические исследования.

Борде Жангу реакция - иммунологическая реакция, основанная на свойстве комплекса антиген -- антитело фиксировать свободный комплемент. РСК протекает в 2 фазы: 1) адсорбция антител на антигенах, 2) выражение реакции (бактериолиз или гемолиз), для которого необходимо присутствие комплемента. Зависимость бактериолитических реакций от присутствия комплемента позволяет выявить взаимодействие антител с антигенами в реакции Борде Жангу. Показателем соответствия антител в этой реакции служит фиксирование комплемента соответствующими иммунными системами, выявляемое добавлением к реакционной смеси «индикаторной» гемолитической системы.

Реакция Борде Жангу осуществляется в два этапа: сначала изучаемые антигены и антитела помещают в условия, обеспечивающие их взаимодействие в присутствии комплемента, а после завершения адсорбции к анализируемой иммунной системе добавляется гемолитическая система (гемолизин + + эритроциты). При соответствии антигенов и антител происходит их взаимодействие и присутствующий в реагирующей смеси комплемент фиксируется иммунной системой. В этом случае при добавлении индикаторной системы гемолиза не происходит ввиду отсутствия комплемента (реакция положительная). Если анализируемые антитела не адсорбируются на антигенах, то комплемент в реагирующей смеси остается свободным и при добавлении гемолитической системы осуществляется гемолиз (реакция отрицательная).

Принцип разработанного Борде и Жангу метода серологического анализа лег в основу многочисленных модификаций реакции, используемой в диагностической практике и научно-исследовательской работе.

Обычная РСК, при которой регистрируется 100% лизис эритроцитов, предусматривает необходимость предварительного титрования комплемента; последний добавляется к иммунной системе в дозе, не превышающей необходимой для гемолитической реакции. Схемы постановки реакции определяются ее целью. В опыте могут испытываться различные дозы антигена при постоянном содержании сыворотки и комплемента, различные разведения сыворотки при постоянных дозах антигена и комплемента и т. д. Ингредиентами реакции являются: 1) испытуемая сыворотка, прогретая в течение 30 мин. при 56° с целью инактивации присутствующего в ней комплемента; 2) антигены (в качестве которых используют суспензии бактерий, экстрагированные из них белки , полисахариды и др.), экстракты из клеток растений и животных, вирусы и т. д., 3) комплемент - свежая сыворотка морских свинок, 4) гемолитическая система (сенсибилизированные бараньи эритроциты) - 5% суспензия эритроцитов, контактировавших с гемолитической сывороткой в течение 30 мин. при t° 37°.

Для разведения ингредиентов используют физиологический раствор NaCl. Антикомплементарность отдельных ингредиентов испытывается в контрольных пробах. Первый этап реакции (адсорбция антител) осуществляется при t° 37° в течение 60 мин. либо при 4-6° в течение 18- 20 час. (РСК на холоде). В последнем случае происходит более полная фиксация комплемента, что увеличивает чувствительность метода. На втором этапе реакционные смеси выдерживают при t° 37°. Результат регистрируют в момент 100% гемолиза в контрольных пробах.

В диагностической практике используют активные, а также «непрямые» методы реакции связывания комплемента, являющиеся модификациями реакции Борде Жангу. В первых из них показателем реакции служит изменение содержания комплемента в испытуемой сыворотке. Вторые основаны на том, что при некоторых заболеваниях сыворотки не содержат комплементсвязывающих антител, но способны предотвращать реакции с сыворотками, обладающими комплементсвязывающей активностью.

Наибольшая чувствительность и точность присуща количественной РСК, в которой регистрируют гемолиз в зоне частичного лизиса. Чувствительность данной модификации реакции Борде Жангу обусловлена тем, что в средней зоне лизиса (20-80%) отношение количества комплемента к количеству лизируемых эритроцитов имеет линейный характер . В основе этой реакции лежит специальный метод титрования комплемента, количество которого выражается в 50% единицах (Сн50) и подсчитывается на основе уравнения Крога, представляющего ход гемолиза в зоне частичного лизиса.

Степень гемолиза устанавливается при помощи спектрофотометра или фотоэлектроколориметра.

Количественная РСК в свою очередь имеет ряд модификаций. В частности, микрометод обеспечивает большую точность определений при малом расходе ингредиентов.

; 2) выражение реакции в присутствии гемолитической системы ().

Для постановки РСК изучаемые объекты (антитела и антигены) помещают в условия, обеспечивающие их взаимодействие в присутствии комплемента; затем к анализируемой иммунной системе добавляют «индикатор» - гемолитическую систему. Если комплемент фиксировался иммунной системой, гемолиза не происходит (положительная РСК; рис., а); если же иммунная система не фиксировала комплемент и ее компоненты не соответствуют друг другу, гемолиз происходит (отрицательная РСК; рис., б). Ингредиенты реакции: 1) испытуемая , инактивированная прогревом в течение 30 мин. при t° 56°; 2) антиген (взвеси бактерий, экстракты органов и тканей, ); 3) комплемент (свежая сыворотка морской свинки); 4) гемолитическая система (сенсибилизированные барана, инкубированные с гемолитической сывороткой в течение 30 мин. при t° 37°). Для разведения ингредиентов используют изотонический раствор хлорида натрия. Первый этап РСК продолжается 60 мин. при t° 37° или 18-20 час. при t° 4-6° (более чувствительная РСК), второй этап - 60 мин. при t° 37°.

Схема реакции связывания комплемента: а - положительная; б - отрицательная. 1 - комплемент; 2 - сыворотка больного; 3 - сыворотка здорового; 4 - антиген; 5 - гемолитическая сыворотка; 6 - эритроциты барана.

Борде - Жангу реакция - иммунологическая реакция, основанная на свойстве комплекса антиген - антитело фиксировать свободный комплемент. РСК протекает в 2 фазы: 1) адсорбция антител на антигенах, 2) выражение реакции (бактериолиз или гемолиз), для которого необходимо присутствие комплемента. Зависимость бактериолитических реакций от присутствия комплемента позволяет выявить взаимодействие антител с антигенами в реакции Борде - Жангу. Показателем соответствия антител в этой реакции служит фиксирование комплемента соответствующими иммунными системами, выявляемое добавлением к реакционной смеси «индикаторной» гемолитической системы.

Реакция Борде - Жангу осуществляется в два этапа: сначала изучаемые антигены и антитела помещают в условия, обеспечивающие их взаимодействие в присутствии комплемента, а после завершения адсорбции к анализируемой иммунной системе добавляется гемолитическая система (гемолизин + + эритроциты). При соответствии антигенов и антител происходит их взаимодействие и присутствующий в реагирующей смеси комплемент фиксируется иммунной системой. В этом случае при добавлении индикаторной системы гемолиза не происходит ввиду отсутствия комплемента (реакция положительная). Если анализируемые антитела не адсорбируются на антигенах, то комплемент в реагирующей смеси остается свободным и при добавлении гемолитической системы осуществляется гемолиз (реакция отрицательная).

Обычная РСК, при которой регистрируется 100% лизис эритроцитов, предусматривает необходимость предварительного титрования комплемента; последний добавляется к иммунной системе в дозе, не превышающей необходимой для гемолитической реакции. Схемы постановки реакции определяются ее целью. В опыте могут испытываться различные дозы антигена при постоянном содержании сыворотки и комплемента, различные разведения сыворотки при постоянных дозах антигена и комплемента и т. д. Ингредиентами реакции являются: 1) испытуемая сыворотка, прогретая в течение 30 мин. при 56° с целью инактивации присутствующего в ней комплемента; 2) антигены (в качестве которых используют суспензии бактерий, экстрагированные из них белки, полисахариды и др.), экстракты из клеток растений и животных, вирусы и т. д., 3) комплемент - свежая сыворотка морских свинок, 4) гемолитическая система (сенсибилизированные бараньи эритроциты) - 5% суспензия эритроцитов, контактировавших с гемолитической сывороткой в течение 30 мин. при t° 37°.

В диагностической практике используют активные, а также «непрямые» методы реакции связывания комплемента, являющиеся модификациями реакции Борде - Жангу. В первых из них показателем реакции служит изменение содержания комплемента в испытуемой сыворотке. Вторые основаны на том, что при некоторых заболеваниях сыворотки не содержат комплементсвязывающих антител, но способны предотвращать реакции с сыворотками, обладающими комплементсвязывающей активностью.

Наибольшая чувствительность и точность присуща количественной РСК, в которой регистрируют гемолиз в зоне частичного лизиса. Чувствительность данной модификации реакции Борде - Жангу обусловлена тем, что в средней зоне лизиса (20-80%) отношение количества комплемента к количеству лизируемых эритроцитов имеет линейный характер. В основе этой реакции лежит специальный метод титрования комплемента, количество которого выражается в 50% единицах (С H50) и подсчитывается на основе уравнения Крога, представляющего ход гемолиза в зоне частичного лизиса. Согласно уравнению, где x - количество взятого комплемента, y - степень гемолиза, выраженная как часть единицы, k - доза комплемента, дающая 50% лизис, а показатель 1/n выражает степень наклона гемолитической кривой.

Степень гемолиза устанавливается при помощи спектрофотометра или фотоэлектроколориметра.

116. Провокации при гонорее

Дополнительный метод исследования . Применяется в том случае, когда гонококков обнаружить не удается, а клиническая картина подозрительна на гонорею, а также как критерий качества терапии после ее окончания. Используют определенные методы воздействия на организм в целом и мочеполовой аппарат (главным образом на мочеиспускательный канал), что ведет к обострению имеющегося воспалительного процесса. После проведения провокации у больного в течение 3 дней берут материал для исследования на содержание гонококков. Применяют следующие виды провокации.

Алиментарная - назначение больному острой и соленой пищи, пива, в состав которого входит хмель, содержащий лопулин, выводящийся из организма преимущественно почками. Проходя через мочеиспускательный канал, он раздражает его слизистую оболочку.
Иммунобиологическая - внутримышечное введение 0,5 мл (500 млн. микробных тел) гонококковой вакцины. В последнее время провокацию с помощью гоновакцины комбинируют с внутримышечным введением 50-200 МПД пирогенала или продигиозана. Женщинам в стационарных условиях гоновакцину в дозе 50-100 млн. микробных тел вводят в шейку матки.
Механическая - введение в мочеиспускательный канал прямого бужа, размер которого соответствует размеру наружного отверстия мочеиспускательного канала. Вместо бужа можно использовать тубус уретроскопа Валентина, особенно в тех случаях, когда при дальнейшем исследовании необходимо сделать уретроскопию. Простерилизованный и охлажденный буж смазывают глицерином и вводят на 10 мин в мочеиспускательный канал, мужчинам - в передний его отдел. Затем производят легкий массаж мочеиспускательного канала на буже с целью получения секрета желез мочеиспускательного канала (рис. 13).
Химическая - введение в мочеиспускательный канал химических раздражающих веществ, чаще серебра нитрата (3-4 мл 0,5-1 % раствора у мужчин, 3-4 мл 1-2 % раствора - у женщин; 3-5 % раствор для смазывания канала шейки матки). Для раздражения слизистой оболочки шейки матки можно использовать раствор Люголя. Мазки после химической провокации лучше брать спустя 2-3 дня. В первые дни в выделениях из мочеиспускательного канала и канала шейки матки обнаруживают много
эпителиальных клеток отторженной слизистой оболочки, что часто затрудняет микроскопическое исследование (рис. 14).
Физиотерапевтическая, или термическая, - использование диатермии, реже - интравагинальных грязевых тампонов. Абдоминально-вагинально-сакральную диатермию назначают женщинам ежедневно по 30-40 мин в течение 3 дней. Мазки берут спустя 2 ч после каждой процедуры.
Физиологическая - взятие мазка у женщин из канала шейки матки во время менструации и в течение 3 дней после нее.

Рис. 13. Массаж мочеиспускательного канала на металлическом буже

Рис. 14. Инсталляция раствора в мочеиспускательный канал
На практике чаще всего используют комбинированную провокацию.

Мы считаем наиболее удачными комбинации: иммунобиологической и механической провокации - у мужчин; иммунобиологической, термической и физиологической - у женщин.

Первую провокацию обычно проводят спустя неделю после окончания лечения, следующую - через месяц.

Следует отметить, что отрицательные результаты провокации не всегда могут служить неоспоримым критерием излеченности.

117. Пункция лимфатического узла

Производится при подозрении на сифилис в серонегативный первичный период в случаях, когда при исследовании тканевой жидкости поверхности шанкра не выявлены бледные трепонемы или когда из-за фимоза исследование ее невозможно. Данную манипуляцию производят также у тех больных, у которых к моменту обращения их к врачу наступила эпителизация эрозивного шанкра.

Исследуют регионарный склераденит, кожу над которым обрабатывают раствором йода спиртовым 5 %. Затем шприцем емкостью 2 или 5 мл с хорошо притертым поршнем и короткой толстой иглой делают прокол в центре бубона по его длинной оси на глубину 1-1,5 см. Производят энергичный массаж узла с постепенным извлечением из него иглы и поднятием поршня.

Если игла была введена правильно, то в пунктате должны быть лимфоциты.

Взятую таким способом жидкость исследуют под микроскопом в темном поле зрения (см. № 68).

При наличии сифилиса и правильной технике выполнения пункции бледную трепонему обнаруживают в 80-85 % случаев.
118. Пункция поясничная

Пункция поясничная, или взятие спинномозговой жидкости, является малым оперативным вмешательством и поэтому должна проводиться в условиях строгого соблюдения правил асептики и антисептики. Для ее проведения необходимо иметь стерильный материал: салфетки, шарики из ваты, раствор Люголя, этиловый спирт 96 %, пинцет или палочки, клеол, специальные простерилизованные кипячением пункционные иглы с мандренами. Диаметр иглы 1,5-0,4 мм, длина -8-12 см. Лучше пользоваться иглой диаметром 0,5-0,6 мм, что уменьшает травматичность процедуры. Поясничную пункцию делают в положении больного сидя или лежа . Мы считаем более удобным первый вариант. Полуобнаженного больного усаживают на край стола или лучше на высокую тумбочку. Под ноги ставят высокий табурет с таким расчетом, чтобы колени были максимально приближены к животу. Больного просят сложить руки на животе, голову наклоняют вперед так, чтобы подбородок касался груди, при этом спина выгибается в виде дуги, туловище не должно быть наклонено вниз. При таком положении остистые отростки позвонков максимально раздвигаются, оставляя место для введения иглы. Место прокола выбирают между IV и V или III и IV поясничными позвонками. Палочкой с намотанной на ее конец ватой, смоченной в растворе Люголя, проводят горизонтальную линию, соединяющую верхние края гребней подвздошных костей (линия Якоби). Пересечение этой линии с вертикальной линией, проходящей через середину остистых отростков, и будет соответствовать месту прокола (рис. 15). При прощупывании выявляют незначительное западение. В этом месте ногтем ставят знак в виде креста (место прокола). Врач тщательно моет руки с мылом, высушивает стерильными тампонами, смазывает раствором Люголя и тщательно протирает этиловым спиртом. Кожу больного смазывают раствором Люголя или раствором йода спиртовым 5 %, затем энергично протирают этиловым спиртом и высушивают стерильным марлевым тампоном. Внутрикожно вводят до образования «лимонной корки» 0,5-1 мл 1 % раствора новокаина с целью анестезии, особенно больным с лабильной нервной системой . Через 1-2 мин пункционную иглу вводят непосредственно под остистый отросток IV поясничного позвонка по средней линии, медленно продвигая ее вперед и несколько вверх. Правой руке врача, которая является как бы направляющей, помогает левая, проталкивая иглу вперед. Продвинув иглу на 4-5 см, врач ощущает небольшой хруст (прокол желтой связки), после этого извлекает мандрен, и из иглы начинает вытекать спинномозговая жидкость. В норме она прозрачная, вытекает каплями, которые можно сосчитать. Если жидкость вытекает струей, то это свидетельствует о повышенном давлении в спинномозговом канале. 3-4 мл жидкости собирают в две стерильные пробирки и направляют в лабораторию на исследование. Ватой, смоченной этиловым спиртом, придерживают кожу у основания иглы и медленными винтообразными движениями извлекают ее. Место прокола смазывают раствором йода спиртовым 5 % и накладывают стерильную коллоидную повязку.

Рис. 15. Схема спинномозговой пункции

После пункции больного осторожно укладывают в горизонтальном положении в постель животом вниз и не разрешают двигаться в течение 3-4 ч. Затем можно поворачиваться в постели, желательно не вставать в течение суток . Больным с лабильной нервной системой дают седативные препараты (хлозепид, или элениум, триоксазин, препараты брома, валерианы). С целью профилактики возможных осложнений - раздражения мозговых оболочек - в последующие 2-3 дня внутривенно вводят 5-10 мл 40 % раствора гексаметилентетрамина (уротропина).

Исследование спинномозговой жидкости является необходимым условием для правильной диагностики, выбора тактики лечения и оценки его эффективности при сифилисе. К сожалению, многие врачи недооценивают практическую важность этого метода. В спинномозговой жидкости определяют содержание белка (норма -до 0,4 %), подсчитывают количество форменных элементов (норма - менее 8 клеток),

проводят реакции: Нонне - Апельта и Панди (норма ++), одну из коллоидных (лучше с золота хлоридом), Вассермана в разведениях 0,1; 0,25; 0,5 при наличии в пробирке 2,5 мл жидкости. По возможности ставят реакцию иммунофлюоресценции (РИФ) и реакцию иммобилизации бледных трепонем (РИБТ). Реакцию Вассермана (с кардиолишшовым и липидным антигенами), РИФ и РИТ проводят общепринятыми методами (см. №119, 121, 123, 124).
119. Реакции Панди и Нонне - Апельта

В качестве реактива для проведения реакции Панди используют надосадочную прозрачную жидкость, которую получают при сильном взбалтывании 100 г жидкой карболовой кислоты с 1000 мл дистиллированной воды. Для получения осадка и прозрачной жидкости (реактива) данную смесь помещают сначала на 3-4 ч в термостат , а затем 2-3 дня выдерживают при комнатной температуре.

Часовое или предметное стекло кладут на темную бумагу и наносят на него 2-3 капли реактива, затем 1 каплю спинномозговой жидкости. При помутнении капли или появлении нитевидной мути по ее периферии реакцию считают положительной.

Для проведения реакции Нонне - Апельта необходимы чистые пробирки, насыщенный раствор аммония сульфата, дистиллированная вода, темная бумага. Насыщенный раствор аммония сульфата готовят следующим образом: в колбу емкостью 1000 мл помещают 0,5 г химически чистого нейтрального аммония сульфата, затем наливают 100 мл дистиллированной воды, подогретой до 95 °С, взбалтывают до полного растворения соли и оставляют на несколько дней при комнатной температуре. Спустя 2-3 дня раствор фильтруют и определяют рН. Реакция должна быть нейтральной.

В пробирку наливают 0,5-1 мл полученного раствора и осторожно по стенке пробирки добавляют такое же количество спинномозговой жидкости. Через 3 мин оценивают результат. Появление беловатого кольца свидетельствует о положительной реакции. Затем содержимое пробирки взбалтывают, определяют степень помутнения, сравнивая с пробиркой, содержащей дистиллированную воду. Результаты реакции оценивают на фоне черной бумаги.
120. Реакция Борде - Жангу

Ценный диагностический тест при выявлении хронической гонореи среди лиц, страдающих хроническими воспалительными заболеваниями мочеполовой системы. По данным литературы, при правильном использовании этого метода выявляют до 80 % случаев гонореи, не обнаруженной бактериоскопическим или бактериологическим методом.

Реакция Борде - Жангу может быть следовой в результате перенесенного ранее заболевания или применения гоновакцины с диагностической (иммунобиологический метод провокации), а также лечебной (лечение хронических воспалительных процессов мочеполовой системы у женщин по Бакшееву) целью. Поэтому перед ее проведением необходимо тщательно собрать анамнез,

Реакция может быть и ложноположительной при введении молока, использовании в лечебных целях пирогенала.

Следовательно, положительная реакция Борде - Жангу не служит бесспорным доказательством наличия гонококковой инфекции, как и отрицательная не может быть свидетельством отсутствия гонореи. Однако положительные результаты ее в течение длительного времени должны нацелить врача на поиск очага гонококковой инфекции в организме.

В качестве антигена используют убитую гонококковую культуру, содержащую 3-4 млрд. микробных тел в 1 мл. Гонококковый антиген консервируют раствором формальдегида и разливают в ампулы по 1- 5 мл. Не вскрытые ампулы пригодны в течение 6 мес, вскрытые можно сохранять 2-3 дня в стерильной пробирке в холодильной камере при температуре 3-5 °С,

Реакцию связывания комплемента Борде - Жангу проводят аналогично реакции Вассермана (см. № 121). Гонококковый антиген разводят изотоническим раствором натрия хлорида соответственно указанному на этикетке ампулы титру. Реакцию проводят чаще всего в объеме 2,5 мл, поэтому к 0,5 мл разведенной 1: 5 испытуемой сыворотки добавляют в каждую пробирку по 0,5 мл разведенного антигена. Остальные 1,5 мл составляют 1 мл гемолитической системы и 0,5 мл комплемента.

Реакцию считают положительной при наличии выраженной в разной степени задержки гемолиза в испытуемой сыворотке. В контроле (сыворотка крови здоровых людей) наблюдается полный гемолиз.

121. Реакция Вассермана

В сыворотке крови больных сифилисом находятся реагины и антитела. Реагины обладают свойством вступать в соединения с кардиолипиновым антигеном. Специфические антитела против бледной трепонемы вступают в соединение со специфическими антигенами. Образовавшиеся комплексы антиген - антитело сорбируют добавляемым в реакцию комплементом . Индикацию производят путем введения гемолитической системы (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка).

Для проведения реакции требуются:

а) изотонический раствор натрия хлорида;

б) ультраозвученный трепонемный (хранят в холодильнике при температуре +4 °С) и кардиолипиновый (хранят при комнатной температуре) антигены;

в) комплемент, представляющий собой сыворотку крови, полученной при пункции сердца 5-10 здоровых гвинейских свинок. Может сохраняться в холодильнике в течение 2 мес при условии

консервирования 4 % раствором борной кислоты и 5 % раствором натрия Сульфата;

г) гемолизин - гемолитическая сыворотка крови кролика, иммунизированная эритроцитами барана с разными титрами (хранят в холодильнике при температуре 4 °С);

д) эритроциты барана, получаемые пункцией яремной вены. Кровь собирают в стерильную банку со стеклянными шариками (для перемешивания), встряхивают 15 мин. Сгустки фибрина отделяют фильтрованием через стерильную марлю. Дефибринированную кровь можно хранить в холодильнике до 5 сут.
Иногда возникает необходимость более длительного хранения крови барана, в связи с чем ее консервируют специальным консервантом (6 г глюкозы, 4,5 г кислоты борной, 100 мл изотонического раствора натрия хлорида), который кипятят на водяной бане по 20 мин в день в течение 3 сут. На 100 мл дефибринированной крови барана требуется 15 мл консерванта. Консервированную таким образом дефибринированную кровь хранят в холодильнике.
Проведению основного опыта предшествует несколько этапов.

У больного из локтевой вены берут 5-10 мл крови и обрабатывают сыворотку. У детей кровь можно взять из височной вены или разреза на пятке. Пункцию делают стерильными инструментами, шприц и иглу
предварительно промывают изотоническим раствором натрия хлорида.

Кровь для исследования берут натощак; за 3-4 дня до исследования больному запрещают употреблять наркотические средства, препараты наперстянки, принимать алкоголь.

Не следует проводить исследование у больных с повышенной температурой тела, после травмы, операции, наркоза, перенесенных недавно инфекционных заболеваний, у женщин во время менструации, у беременных (в последние 10 дней беременности), рожениц (в первые 10 дней после родов), а также новорожденных (в первые 10 дней жизни).

Полученную кровь в стерильной пробирке помещают на 15-30 мин в термостат при температуре 37 °С. Образовавшийся сгусток отделяют от стенок пробирки стерильной стеклянной палочкой и ставят в холодильник на сутки. Отделившуюся прозрачную сыворотку (над сгустком) отсасывают пастеровской пипеткой с помощью резиновой груши либо осторожно сливают в другую стерильную пробирку и инактивируют на водяной бане в течение 30 мин при температуре 56 °С. Приготовленную таким образом для опыта сыворотку можно хранить в холодильнике до 5-6 дней.

Антигены разводят соответственно способу и титру, указанным на этикетке.
Приготавливают гемолитическую систему. Для этого дефибринированную кровь или эритроциты барана в количестве , необходимом для проведения реакции, центрифугируют, плазму осторожно отделяют, а осадок промывают 5-6 объемами изотонического раствора натрия хлорида до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет совершенно бесцветной. Из осадка готовят 3 % взвесь эритроцитов в изотоническом растворе натрия хлорида по утроенному титру.

Раствор гемолитической сыворотки и взвесь эритроцитов барана быстро смешивают и помещают в термостат на 30 мин.

Сухой комплемент разводят изотоническим раствором натрия хлорида в пропорции 1:10, нормальную инактивированную сыворотку человека- 1:5.

Комплемент титруют в 30 пробирках, помещенных в штатив по 10 пробирок в 3 ряда. В двух рядах его титруют в присутствии двух антигенов, в третьем - с изотоническим раствором натрия хлорида. Пять пробирок являются контрольными: две для соответствующих двух антигенов и по одной - для контроля комплемента, гемолитической сыворотки и изотонического раствора натрия хлорида на гемотоксичность; заполняют их следующим образом:

Реактивы, мл	Ряд пробирок
	1-й	2-й	3-й	4-й	5 и
3 % взвесь эритроцитов барана	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25

Гемолитическая сыворотка, разведенная по утроенному титру	-	0,25	-	-	-
Комплемент 1:10	0,25	-	-	-	-
Трипонемный антиген, разведённый по титру	-	-	-	-	-
Кардиолипиновый антиген, разведённый по титру	-	-	-	-	0,5
Изотонический раствор натрия хлоприда	0,75	0,75	1,0	0,5	0,5

Пробирки помещают на 45 мин в термостат, после чего их проверяют. Гемолиза не должно быть ни в одной пробирке.

Комплемент в разведении 1:10 разливают в 10 пробирок 1-го ряда штатива в дозах: 0,1, 0,16, 0,2,0,24, 0,3, 0,36,0,4,0,44, 0,5 и 0,55 мл. К содержимому каждой пробирки добавляют изотонический раствор натрия хлорида до 1 мл и тщательно перемешивают. По 0,25 мл смеси из каждой пробирки переносят в соответствующие пробирки 2-го и 3-го рядов. Штатив с пробирками встряхивают, в 3-й ряд пробирок добавляют по 0,5 мл гемолитической системы, вновь встряхивают и помещают на 45 мин в термостат при температуре 37 °С. Нормальную сыворотку крови человека, разведенную изотоническим раствором натрия хлорида в пропорции 1:5, по 0,25 мл разливают во все 30 пробирок.

Антиген I (трепонемный ультраозвученный), разведенный по титру изотоническим раствором натрия хлорида, по 0,25 мл добавляют в 10 пробирок 1-го ряда; антиген II (кардиолипиновый в том же разведении и в том же количестве) - в 10 пробирок 2-го ряда. В 10 пробирок 3-го ряда приливают по 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида, оставшиеся 0,25 мл выливают. После инкубации в термостате в 20 пробирок (1-го и 2-го ряда) добавляют по 0,5 мл гемолитической системы, встряхивают и повторно помещают в термостат на 45 мин.

Через 45 мин определяют рабочую дозу комплемента, то есть титр его с надбавкой в пределах 15-20 %.

Титром комплемента считают его минимальное количество, вызывающее полный гемолиз эритроцитов барана в присутствии антигена и нормальной сыворотки крови человека.

Основной опыт заключается в том, что каждую испытуемую инактивированную сыворотку, разведенную в пропорции 1: 5 изотоническим раствором натрия хлорида, разливают по 0,25 мл в три пробирки. В первую пробирку добавляют 0,25 мл антигена I, во вторую - 0,25 мл антигена II, в третью (контроль) -0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида. Во все пробирки добавляют также по 0,25 мл разведенного до рабочей дозы комплемента. Все пробирки помещают на 45 мин в термостат, затем в них добавляют по 0,5 мл гемолитической системы, встряхивают и ставят в термостат на 45-50 мин. Результат опыта регистрируют после наступления полного гемолиза в контрольных пробирках.

Результаты реакции оценивают плюсами: полная задержка гемолиза (резкоположительная реакция) ++++, значительная (положительная реакция) +++, частичная (слабоположительная реакция) ++, незначительная (сомнительная реакция) - ±, отсутствие задержки гемолиза (отрицательная реакция) -.

При количественном методе проведения реакции Вассермана опыт ставят с уменьшающимися объемами сыворотки, разведенной изотоническим раствором натрия хлорида.
Схема проведения основного опыта реакции Вассермана

Ингредиенты (в мл). Общий объем 1,25 мл	№ пробирок
Ингредиенты (в мл). Общий объем 1,25 мл	I	Ц	III
Испытуемая сыворотка инактивированная, разведенная в пропорции 1: 5 Антиген I (трепонемный), разведенный по титру Антиген II (кардиолипиновый), разведенный по титру Изотонический раствор натрия хлорида Комплемент, разведенный по рабочей дозе	0,25 0,25	0,25	0,25
	-	0,25	-
	0,25	0,25	0,25 0,25

Клиническое значение реакции Вассермана трудно переоценить. Ее проводят всем больным до начала лечения, но особое значение она имеет при скрытом сифилисе, поражении внутренних органов и нервной системы.

Результаты реакции Вассермана характеризуют качество проведенного лечения , что дает основание в определенные сроки снимать с учета лечившихся больных.

При первичном сифилисе реакция Вассермана положительная обычно в конце 6-й недели с момента заражения; при вторичном свежем сифилисе она положительная почти в 100 % случаев, при вторичном рецидивном -в 98-100%; третичном активном - в 85%; третичном скрытом - в 60 % случаев.

Реакцию Вассермана проводят двукратно всем беременным, больным с соматическими, нервными, психическими и кожными болезнями, а также декретируемым контингентам населения. В то же время к.положительным и слабоположительным результатам реакции следует относиться критически, так как они могут быть в конце беременности и после родов, при гипертиреозе, малярии, проказе, распаде злокачественной опухоли, инфекционных заболеваниях, коллагенозах и др. Поэтому при наличии клинических проявлений болезни их следует учитывать, наряду с данными бактериоскопии, в первую очередь.

Вместе с тем имеются факторы , которые могут исказить истинный характер полученных результатов реакции Вассермана: плохо вымытая лабораторная посуда (следы кислоты и щелочи в пробирках), длительное хранение крови, взятой для исследования, употребление больными жиров и алкоголя перед обследованием, период менструации и др.